6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工(4)

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

影响电泳的因素如下：待分离的生物大分子的性质、电场强度、缓冲液的性质、支持介质的筛孔、电渗。

三、 实验材料与方法：

1、

2、 实验材料：小麦幼苗 仪器：

（1）电泳仪一套（稳定电源及垂直板电泳槽）

（2）移液器

（3）烧杯 50ml 3个

（4）微量进样品(100ul)

（5）大培养皿一套

（6）pH试纸

3、 试剂：贮液配臵表

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

实验方法：

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

1. 凝胶的制备：

（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液

（2）安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡用力，以免夹碎玻璃片

（3）用 2%的琼脂糖封底，以防漏胶

（4）按下表所示配制分离胶

在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端 抵在长玻璃片顶端中央某点，小心倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端 2 厘米左右即 可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约 2-3 毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静臵一会儿（此过程大约10分钟），便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。

（4）按下表所示配制浓缩胶：

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片 0.5 厘米左右即 可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。此过程大约15分钟

2．点样： 用微量进样器将根、叶样本分别各加：5μl ，15μl，20μl，30μl，40μl

3．电泳

接好电源线(上槽接负极，下槽接正极 )。打开电源开关，调节电流，初始时控制在 15mA 左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到 30mA左右，待前沿指示染料下行至距胶板末端 1~2 厘米处，即可停止电泳。

4．剥胶、染色及记录结果 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地胶臵于大培养皿中，进行染色反应（浓缩胶可以去掉）。

过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。

染色过程如下：

（1）向大培养皿中倒入约 50ml pH4.7 乙酸缓冲注，将胶板淹没，室温浸泡 10 分钟。

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

（2）倒掉乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20分钟，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，观察记录酶谱。

四、 实验结果：见附图

五、 结果分析：

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。

如图中所示，左侧为根，右侧为叶，浓度梯度也不同。电泳后不同的蛋白质在电泳中分成不同的条带，样品槽下端有微量的绿色，应该是样品液中的叶绿素，实验结果基本清晰，分层较明显，实验应为成功。

六、 参考文献：

1、 兰海燕 李立会，《蛋白质凝胶电泳技术在作物品种鉴定中的应用》，

中国农业科学，2002 ，35（8）：916-920

2、 沈新明，江培洲，黄华，李欣，姚开泰(第一军医大学肿瘤研究所，广东

广州510515)，《运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和图像软件分析TPA处理NIH3T3细胞前后的蛋白质表达谱差异》，第一军医大学学报(J First Mil Med Univ），2004，,2（3）

3、 曹成喜 等，《生物化学仪器分析基础》，2008，化学工业出版社

4、 孙培龙 吴石金，《生物化学技术实验指导》，2008，化学工业出版社

5、 张龙翔 张庭芳 李玲媛，《生化试验方法和技术》，1997，高等教育出版