高中生物病毒典例H5N1型高致病性禽流感病毒简介

高中生物病毒典例H5N1型高致病性禽流感病毒简介

【摘要】在高中生物中，病毒是一种非常特殊的非细胞结构的微生物，H5N1是一种近年来比较高发的人、禽、兽共患的新发传染病，H5N1是以RNA为遗传物质的逆转录病毒，是帮助高中阶段学生学习病毒知识、扩充中心法则的典型实例。本文详细介绍了这种就病毒的结构特点、禽流感病毒和人流感病毒的关系、致病机理和疫苗研究现状进行综述。

【关键词】H5N1高致病性禽流感病毒；结构；致病机制；疫苗研究

在高中生物的学习过程中，在必修一 “细胞的类型和结构”一节中，学生首次接触了除原核细胞和真核细胞以外，还存在着病毒这种非细胞结构的生物；在必修二“探究遗传物质的过程”一节中，学生又一次接触到了不同类型的病毒：DNA和RNA病毒；在接下来学习的“中心法则及其发展”中，又涉及到了逆转录病毒的知识。但是在高中生物的几本书中，并没有专门的章节来介绍病毒这种特殊的生物。因此本文以人流感病毒的近亲高致病性禽流感病毒为例，来介绍此种逆转录病毒的基本知识和研究现状。

1 禽流感病毒的结构

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒(Avianinfluenza virus，AIV)引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度接触性、急性传染病，鸡、鸭等家禽及鸟类等野禽均可感染。亚洲、美洲、欧洲的许多国家和地区都曾发生过此病，给养禽业造成了巨大的损失。禽流感不仅可以在家禽中传播，而且还可以由家禽传染给人类，直接威胁人类的健康。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)已被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，并被列入国际生物武器公约动物传染病名单，我国也将其列为一类动物疫病。

禽流感病毒AIV属RNA病毒的正黏病毒科，流感病毒属，是一种核糖核酸(RNA)病毒。病毒毒粒大致呈圆形，直径为80～120纳米。禽流感病毒主要由包膜和核衣壳构成。包膜由纤突，双层类脂膜和基质蛋白构成。纤突是在双层类脂膜上的密集钉状物或纤突覆盖，呈放射状排列，是糖蛋白插入并在毒粒表面形成突起，长度约为12-14 nm。在毒粒表面形成突起的糖蛋白有两种：一类是呈棒状，由血凝素分子的三聚体构成(HA)在病毒吸附和穿膜过程中以及决定病毒致病力的方面均起到关键的作用；另一种是呈蘑菇状，由具有催化活性的神经氨酸

酶蛋白(NA)的四聚体构成，NA非极性跨膜区起着固定和作为信号肽的双重功能，两种纤突在囊膜上的比例为75：20。对于人的免疫系统而言，这是两种抗原。根据抗原性的不同，AIV可分为A、B、C三型。基质蛋白是病毒粒子内的主要蛋白成分，其形成的基质膜紧贴在类脂双层内面，包围着核衣壳，是维持病毒形态的结构蛋白。AIV的核衣壳呈螺旋对称，核酸为单股负链RNA，分为8个不同的片段，A型和B型AI中，1个～6个片段均编码单个蛋白，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP和NA；第7个和第8个片段均编码2个蛋白，分别为M1、M2和NS1、NS2。这10个病毒蛋白中，有8个是病毒粒子的组成成分(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)，分子质量最小的RNA段编码2个非结构蛋白，即NS1和NS2。在核酸外面包被着螺旋排列的壳粒，主要是由核蛋白(NP)构成。

图1 禽流感病毒模式图

(1)血凝素，简称HA蛋白，H蛋白可以使病毒结合到生物细胞的受体，使其感染；(2)神经氨酸酶，简称N蛋白，N蛋白会破坏细胞的受体，使病毒在宿主体内自由传播；(3)基质蛋白层；(4)禽流感病毒由8个负链的单链RNA片段组成。

图

2禽流感病毒电镜图

病毒颗粒大致呈圆形，直经约80～120纳米。包膜的脂质双分子层上有密集的钉状物和纤突，呈放射状排列，是糖蛋白插入并在毒粒表面形成突起。长度约为12-14 nm。

根据在病毒表面形成突起的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特性，将A型流感病毒分成不同的亚型。目前，有15种特异的HA亚型(H1-H15)和9种特异的NA亚型(N1-N9)。HA和NA的不同组合可能出现在同一种病毒表面，甲型流感病毒则根据HA和NA的不同组合而分为不同的亚型，并根据这种组合来命名。比如，H7N2 病毒代表表面有HA7蛋白和NA2蛋白的甲型流感病毒。与此类似，H5N1病毒的表面则有HA5蛋白和NA1蛋白。只有某些亚型目前在人群中流行，如H1N1，H1N2，和H3N2。其它的亚型常见于其它动物。例如，H7N7和H3N8病毒感染马。

人可以被甲，乙和丙三种流感病毒所感染。通常感染人类的甲型流感病毒只有H1N1，H1N2和H3N2等亚型。在1957 和 1968年流行的H2N2 亚型。现在，它们已不再流行。正常情况下只在人群中可以发现乙型流感病毒。与甲型流感病毒不同，乙型流感病毒并不分为亚型。虽然乙型流感病毒可以引起人类的流行病，但它们从没有引起过大流行。只有甲型流感病毒可以感染鸟类。野鸟是甲型流感病毒所有亚型的天然宿主。当感染甲型流感病毒之后，在典型的情况下，鸟类并不生病。但是，家禽如鸡和火鸡会病得很重甚至因禽流感而死亡。也有些禽流感病毒会使野鸟病重或死亡。一些甲型流感病毒的亚型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物；丙型流感病毒导致的人类疾病较轻微，它们并不会流行或引起瘟疫。这些病毒也不分为亚型。

2 禽流感和人流感的关系

1997年香港发生首例禽流感病毒突破种间障碍直接感染人并致人死亡事件的发生，共有18 人感染了H5N1 禽流感病毒，造成6 人死亡。从患者分离到的H5N1 病毒的8个RNA片段与从当地鸡分离到的H5N1病毒相同。彻底打破了仅有H1、H2、H3亚型流感病毒在自然状态下也可以感染人及其他哺乳动物的常规。

一般来说，有三个方面的原因阻止了禽流感病毒对人类的侵袭。首先，人呼吸道上皮细胞不含禽流感病毒的特异性受体，即禽流感病毒不容易被人体细胞识别并结合；第二，所有能在人群中流行的流感病毒，其基因组必须含有几个人流感病毒的基因片断；第三，高致病性的禽流感病毒由于含碱性氨基酸数目较多，使其在人体内的复制比较困难。

个别造成人感染发病的禽流感病毒可能是发生了变异的病毒。变异的可能性一是两种以上的病毒进入同一细胞进行重组。流感病毒属分节段RNA病毒，众

多的血清亚型是其遗传变异频繁的有力证据，不同毒株间基因重组率很高，流感病毒抗原性变异的频率快，其变异主要以一下方式进行：

①抗原漂移，即基因组自发的点突变引起小幅度的变异，积累到一定程度或正好使抗原决定蔟发生改变；

②抗原转变，即两种不同亚型病毒共同感染同一宿主细胞，两者的基因片段发生遗传重组； 抗原漂移可引起HA和(或)NA的次要抗原变化，而抗原转变可引起HA和(或)NA的主要抗原变化。单一位点突变就能改变表面蛋白的结构，因此也改变了它的抗原或免疫学特性，导致产生抗原性的变异体。而当细胞感染两种不同的流感病毒粒子时，病毒的8个基因组片段可以随机互相交换，发生基因重排。通过基因重排有可能产生高致病性毒株；

③RNA重组，即来自不同宿主的流感病毒在同一宿主内发生基因交替； 如猪既可感染人流感病毒，又可能感染禽流感病毒，每种病毒都具有8个基因片段，从理论上讲，可以形成256个新的重组病毒；二是病毒基因位点由于某种因素的影响，发生了突变；

④缺损性病毒颗粒的产生，1983年4月，美国宾夕法尼亚州曾暴发H5N2型病毒引起的鸡和火鸡低致病性禽流感，由于没有及时得到有效控制，到同年10月份，同样的H5N2型毒株突然由低致病性变成高致病性，造成禽类大量死亡。后来对这两株不同致病力A IV核苷酸的序列进行的比较分析发现，高致病性病株的1个糖基化位点丢失一个寡糖链。在HA的空间结构中，这个寡糖链应位于HA1 和HA2 裂解位点附近，它的存在可能阻止蛋白酶的裂解作用。

AIV基因组中突变率最高的为HA，主要是HA1编码区在持续不断地、快速地发生突变。在HA1 蛋白编码区中所出现的核苷酸变异中，约40%是可以引起所编码氨基酸发生改变的编码改变，其余的为非编码改变。HA1 蛋白的变异多发生在抗原位点处，改变病毒的抗原性，使人群的特异性免疫丧失。发生在HA 受体结合位点上的突变有时可能改变病毒的宿主特异性，而HA上糖基化位点的突变则有可能导致病毒毒力发生根本性的变化。

20世纪人类历史上发生过4 次流感大流行：

①1918～1919年爆发于欧洲的流感大流行，由于最先起源于西班牙而被称为―西班牙流感‖，造成2000多万人死亡，并且以青壮年为主，其病源为H1N1 亚型流感病毒； 由于缺乏病毒分离株， 无法对这次流感的病原做生物特性的研究， 然而血清学记录表明，此次流感由类古典猪流感病毒(H1N1) 引起， 对该病毒的后代病毒进行遗传学分析表明， 该病毒来源于欧亚大陆的禽流感病毒；

②爆发于1957 ～1958 年的―亚洲流感‖；

③爆发于1968～1969年的―香港流感‖，分别由H2N2 及H3N2 亚型流感病毒

引起，仅美国在这2次流感流行中的死亡人数分别为7万和3。 4万。其后30年H3N2 亚型流感病毒又引起16次大流行，造成全球约1000万人死亡； 血清学研究表明， 引起此次大流行的病毒是H2N2 亚型， Kawaoka等。发现该病毒的PB1、HA、NA基因皆来自禽流感病毒， 其他基因仍保留了当时流行于人群中的H1N1病毒的基因；

④1977年H1N1亚型流感病毒在消失20年后又卷土重来，其基因结构与1918 年的流感病毒H1N1病毒的所有8个基因片段均与禽H1N1 高度同源，这证明禽流感病毒不经过基因重配也可直接传播到人。完全相同，具体什么原因尚不清楚。从1977年至今，H1N1和H3N2共同在人群流行。KawaOka等对第3次流行株进行基因研究发现，其PB1和HA 基因来自禽流感病毒，其他6个基因来自当时流行于人群中的H2N2病毒，这也是一个人源和禽源病毒的杂交病毒。

遗传学研究结果证实，每次人类流感大流行的病毒都是通过中间传递的方式来源于动物流感病毒，或者由动物流感和当时的人流感病毒流行株杂交而来， 其根源都是禽流感病毒。

表1 人类面临的主要流感类型

目前，对禽流感病毒感染人类的机制尚不明确，但有一点是明确的，禽流感病毒亚型很多，在自然界分布广泛，是人类流感病毒的大储存库，除可感染家禽和野鸟外，也可引起猪和马等哺乳动物的感染，通常认为禽流感病毒是人流感病毒发生变异的新基因的来源，这种联系是通过中间感染动物(猪、马、海豚)来实现的，禽流感导致人类流感大流行目前有两种假说：

(1)猪作为中间宿主的混合器假说：人类与禽类细胞膜上HA的结合位点差异较大，而猪等中间宿主与禽类的种间障碍较底，存在人流感病毒和禽流感病毒的2种受体，人与禽流感病毒均可感染猪，禽流感病毒可以在中间宿主(猪)中与人流感病毒杂交，从而获得人类细胞特异性的受体结合位点，形成适应人类的流感新毒株。经过在这个混合器中的适应或与其他亚型流感病毒杂交后，有可能产生可以在人体内进行的良好复制的、新的人的流感病毒，从而导致人类流感的大流行。1978年日本从猪体内分离到的H1N2亚型毒株的NA基因来源于人类H3N2 亚型；1987年法国北部地区也在猪体内分离到相似的H1N2重配株。猪在人流感和禽流感之间充当了混合器，能产生感染人的新流感病毒。

(2) 禽流感病毒直接传播给人，人本身充当混合器，禽流感病毒直接感染人类已是事实。可能的机制是禽流感病毒反复传播给人，并在人体内与人的流感病毒进行杂交，产生可在人体内有效复制的病毒；或者是禽流感病毒直接传播给人， 在人体内经过一段时间的适应使其受体特异性发生变化，符合人流感病毒的受体要求，进而在人体内大量繁殖。

3 禽流感的致病机理

高致病性禽流感病毒主要通过空气进行传染，AIV靠近宿主细胞以后，它通过HA特异的识别和结合宿主呼吸道黏膜上皮细胞表面的相应受体，诱导病毒囊膜与细胞膜结合，使病毒粒子能够进入细胞。病毒要具有侵染性，必须经过两个过程： ①宿主蛋白酶将HA 裂解为HA1和HA2；②裂解后的HA2暴露出疏水区并与宿主细胞膜脂双层相互结合。禽流感病毒HA裂解为HA1和HA2是其致病的重要因素， 在病毒入侵细胞及决定病毒致病力方面起着关键作用。这一裂解过程主要取决于HA对蛋白酶切割的敏感性。低致病力禽流感病毒在HA裂解位点上只有一个或两个碱性氨基酸-精氨酸，这种结构只能被存在于呼吸道和消化道内的精氨酸特异蛋白酶识别并裂解，因此，低致病力禽流感病毒感染一般只在呼吸道和消化道内局部繁殖。对禽类危害极大的高致病性禽流感病毒就在HA裂解位点具有多个碱性氨基酸，能使HA对蛋白酶切割的敏感性增强，被机体大多数组

织细胞内的蛋白酶识别并裂解，从而使病毒的致病力提高。所以一旦高致病力禽流感病毒进入机体就会迅速全身扩散，使全身多个组织受感染，导致宿主发病、死亡。总之，HA碱性氨基酸的多少和宿主体内蛋白裂解酶的分布是决定病毒致病能力及其在机体内扩散能力的主要因素。

H5N1亚型禽流感病毒毒毒力较强，引发的传染性变态反应(IV型变态反应)，最终导致人类感染严重的下呼吸道感染、进行性呼吸系统衰竭、急性呼吸窘迫综合证(ARDS)和严重的外呼吸道综合征等严重并发症。英国学者对18 名人禽流感(H5N1)患者和8名感染人流感的患者进行了病原学和免疫学比较，结果发现病人体内的高病毒载量及过度的免疫应答是禽流感病毒(H5N1)致病和死亡的主要原因。

4 高致病性禽流感的疫苗研究现状

由于AIV血清亚型众多，抗原变异频繁，禽类感染AIV后，死亡率高达75% ～90%，使得A I对畜牧业的发展以及人类安全存在巨大威胁。接种禽流感疫苗可大大降低禽流感的发病率，禽流感疫苗包括：高致病性禽流感灭活疫苗、高致病性禽流感亚单位疫苗、高致病性禽流感重组活载体疫苗以及禽流感核酸疫苗等类型。

4.1 高致病性禽流感灭活疫苗

AIV灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，辅以佐剂制备而成的油乳剂疫苗。灭活全病毒疫苗安全性好，抗原成分齐全，免疫原性强，不会出现毒力返强和变异现象，能够经受同种亚型AIV的攻击，流感灭活疫苗便于储备，实验证明具有良好的免疫保护作用，也是目前被广泛应用的免疫疫苗。由于灭活疫苗的抗原量由注射剂量决定，为此必须注射比活疫苗高出许多倍的病毒量，此外还必须添加佐剂，这都增加了灭活疫苗的成本；灭活全病毒油佐剂疫苗的另一缺点是接种动物血清学检测呈阳性，故不能与自然感染相区分，影响疫病的检测。

4.2 禽流感病毒亚单位疫苗

亚单位疫苗是提取A IV具有免疫原性的HA蛋白， 用重组技术生产大量HA 蛋白，并辅以佐剂而成的疫苗。由于禽流感病毒的保护性抗原主要为HA 和NA ，HA糖蛋白和NA蛋白能够产生有保护作用的抗体，NP有种的特异性，能产生有保护作用的抗体和细胞免疫反应。该产品为杆状病毒—昆虫细胞系统表达的H5N1亚型禽流感病毒HA亚单位疫苗，这种疫苗安全性好，也能刺激机体产生足够的免疫力， 能保护鸡只抵抗禽流感病毒， 同时可诱导细胞免疫反应，但免疫

保护持续时间短。重组抗原表位亚单位疫苗是将具有免疫保护作用的人工合成抗原肽结合到载体上，再加上佐剂制成的制剂，大大的增加了成本，且效果不如全病毒灭活疫苗。

4.3 AIV重组活载体疫苗

活载体基因重组疫苗是近年来十分关注的诸多新型疫苗中的一类，它是以利用基因工程方法改造的病毒或细菌作载体，按人们的要求表达特定免疫活性因子。利用对禽类无病原性或致病性很弱的痘病毒、疱疹病毒或禽病毒作载体， 将HA 等保护性抗原重组到病毒基因序列中得到的重组病毒。构建表达HA的重组病毒可在体内复制，表达HA蛋白，从而诱导机体产生针对A IV的免疫保护力。据报道，基于HA基因的活载体疫苗对相同HA亚型病毒的攻击产生近100%的保护，而对其它亚型病毒攻击的保护性较差。1998 年，重组禽痘病毒疫苗获得美国农业部的批准可在紧急情况下使用，并于同年在墨西哥的商品肉鸡群中应用，从而有效地控制了H5N2 的流行。

4.4 核酸疫苗

又称为DNA疫苗，核酸疫苗是将可表达保护性免疫原基因克隆到真核表达载体质粒上，直接导入机体细胞，抗原蛋白经过内源性表达， 并提呈给免疫系统，诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。核酸免疫也称DNA免疫或基因免疫。核酸疫苗不同于传统的弱毒苗、灭活苗及蛋白亚单位苗，它是带有特异抗原基因的真核表达质粒，具有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的能力，核酸疫苗不需要在体外表达纯化蛋白， 相对省时省力， 抗体持续时间长， 只需要一次注射就可产生良好的免疫。在防治病毒感染性疾病中有广阔的应用前景，已成为疫苗研究领域的热点之一。

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