Pre-S蛋白N-糖基化对细胞MHC-I和CD80表达影响研究

申请代码： 受理部门： 收件日期： 受理编号：

C03011402

国家自然科学基金

国家自然科学基金委员会

国家自然科学基金申请书

基本信息

申请者信息依托单位信息合作单位信息

项目名称

项目基本信息

申请经费400字）：细胞免疫在清除HBV感染中起关键作用，其中特异性的糖蛋白分子呈递HBV抗原表位识别是免疫识别的第一与CTL表面的CD28交互作用为免疫识别第二信号。HBV蛋白具有重要生物学和免疫学意义。已知病毒抗原糖基化对免疫应答不清楚。已发现HCV复制子通过增加内质网压力抑制宿主细胞自身合成蛋白的糖基化修饰，影响到MHC-I正常表达。本研究拟在pIL20-HBVS质粒基础上，通过构建新的不同N-糖基化Pre-S真核表达载体，转染人源Huh7细胞株，观察HBV Pre-S抗原表达及N-糖基化修饰对转染细胞MHC-I、CD80等重要免疫识别相关分子N-糖基化修饰、细胞表面表达及特异性CTL识别的影响，为进一步研究HBV免疫逃避机制提供线索。 摘

姓学电传

名

周吉军

性别职称

男

出生年月

1967年11月主要研究领域

民族 汉族 传染病学

要

关 键 词(用分号分开，最多5个)；糖基化；Pre-S；MHC-I；CD80

位 博士 副教授

话 真

电子邮件 个人网页

工作单位 中国人民解放军第三军医大学 /西南医院全军感染病研究所 在研项目批准号名

称

30200242

代 码

中国人民解放军第三军医大学

联系人 杨勇 电

话

电子邮件网站地址

代 码

单 位 名 称

Pre-S蛋白N-糖基化对细胞MHC-I和CD80表达影响研究

资助类别 附注说明 申请代码 基地类别

面上项目

研究

亚说明自由申请项目

年1月 — 2007年12月 研究属性 基础研究

国家自然科学基金申请书

项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏)

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

总人数

姓 名

李俊刚汤勃王洪王方蒋黎刘俊

出生年月 1975-6-10 1973-4-16 1967-8-17 1969-09-09 1974-06-18 1973-10-21

性别男 男 男 女 女 男 高级

职 称 助理研究员 博士后 博士生 讲师 讲师

学 位 硕士 博士 硕士 学士 中级

学学

学学

初级

电话 02368754289

02368754475-8044 02368754289

02368754289

02368754289-8007 02368754289 博士后

电子邮件

ljg579@http://

tobei@http://

wanghong@http://

helon919@http:// jll3008@http:// liujun731021@http://

博士生

项目分工 载体构建 细胞转染 流式细胞检测 SDS-PAGE 免疫沉淀 细胞培养

作时间（月） 4 4 4 4 3 5

硕士生

说明: 1. 2.

第 3 页 版本1.004.937

国家自然科学基金申请书

经费申请表 （金额单位：万元）

科目

一.研究经费 1.科研业务费

（1）测试/计算/分析费 （2）能源/动力费 （3）会议费/差旅费

（4）出版物/文献/信息传播费 （5）其它 2.实验材料费

（1）原材料/试剂/药品购置费 （2）其它 3.仪器设备费 （1）购置 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费

二.1.2.三.劳务费 四.管理费

合 计

申请经费

20.50005.50002.00000.50001.00001.50000.500014.00000.00000.00000.00000.00000.00002.30001.200024.0000

流式细胞仪使用等 水、电费 学术会议、差旅费 评审、鉴定费

试验室简单装修、维修费 临时工工资

按照《国家自然科学基金经费管理办法》

0.00000.00000.0000

备注（计算依据与说明）

国家其他计划资助经费

与本项目相关的 其他经费来源

其他经费资助（含部门匹配）

其他经费来源合计

报告正文

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1、

。 项目的立项依据（附主要的参考文献目录）

乙型肝炎病毒（HBV）感染过程中，细胞免疫，特别是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在清除感染HBV过程中起关键作用，HBV表面抗体作为一种保护性抗体，产生则呈T细胞依赖过程[1]，其出现通常反映感染病毒已被有效清除。CTL能识别感染肝细胞表面MHC-I类糖蛋白分子呈递的HBV抗原表位，这是免疫识别的第一信号。CD80引发抗原特异性和MHC-I限制性抗病毒效应 [2]，

（B7-1）为代表的糖蛋白分子与CTL表面的CD28抗原呈递细胞（APCs）对HBV抗原的加工、MHC-I分子对抗原的呈递是HBVHBV包含 L、M和S，其中绝大部分是S，M和L只占2~5%。Pre-S体实验）发现Pre-S抗原免疫原性却比S2周）；接种仅含S抗原的疫苗出现的无应答者，接种含Pre-S的疫苗却是有效的；蛋白首先接触肝细胞，因此可能是HBV感染配体[2]。S区有糖基化(glycosylation)位点（Asn-X-Ser/Thr）， Pre-S区有2个N-区（Asn15）和Pre-S2（Asn123）。

[3]

⑴N-糖基化对抗体应答有重要影响，N-糖基化与免疫逃避密切相关，其N-糖基上含有超过20个的宿主细胞特异性N-连接聚糖。利用酵母表达的HBV Pre-SAsn15和Asn123上的N-连接聚糖，干扰了针对Pre-S的B细胞应答，导致Pre-S

（neo-epitope），DCs）等APCs摄取、加工和呈递的天然抗原（如病[4]。糖基化可通过改变肽表位的三Ⅰ类分子的结合及与TCR的交互作用。研究表明CTL所识别表位部分MHC-Ⅰ类分子结合，也可通过糖基直接与MHC分子交互作用，恢复结合。申请者也已证实了HBV糖肽特异性的CTL存在（详见工作基础）。

由于病毒蛋白糖基化的复杂多样性和难以操控性，目前相关研究存在一些局限性，病毒抗原修饰后引起表位改变影响免疫应答是引起免疫逃避的一个重要因素，另一方面病毒感染细胞表面的重要免疫识别相关分子表达也对免疫识别产生重要影响，其中下列值得重视的问题有待解决：

⑴虽然研究发现病毒抗原糖基化修饰对免疫应答有重要影响，但病毒蛋白糖基化修饰对宿主细胞重要免疫识别相关分子修饰、表达影响尚不清楚。无论宿主细胞自身糖蛋白还是感染病毒表达糖蛋白，糖

基化修饰均发生在细胞内质网和高尔基器（Golgi），即病毒抗原糖基化修饰利用了宿主细胞自身的翻译后修饰（posttranslational modification）机制。宿主细胞表面MHC-I、CD80等重要免疫识别相关分子均为糖蛋白，糖基化修饰对其正常表达有重要影响，如MHC-I重链糖基化是MHC-I分子正常折叠和装配所必需的（见图1）。

⑵已发现胞内感染病毒的复制表达对宿主细胞自身合成蛋白糖基化修饰有重大影响，利用HCV复制子（replicon）研究发现HCV复制子可通过抑制宿主细胞MHC-I分子呈递抗原给CTL而逃避免疫，这主要因为HCV复制表达增加了内质网的压力，胞内蛋白糖基化修饰受到抑制，糖基化改变干扰了蛋白的正常折叠，导致MHC-I分子装配障碍，不能表达到细胞表面[5]，病毒复制引起内质网压力增加的机制尚不清楚。HBV是否存在类似情况，细胞蛋白糖基化修饰值得研究。

⑶HBV感染细胞逃避宿主抗病毒免疫机制尚不清楚，HCV达这一发现还是为研究HBV主细胞MHC-I、CD80意义。

图1。项目立题思路示意图。Pre-S真核表达载体转染后，翻译、合成Pre-S蛋白，在内质网、高尔基器进行N-糖基化修饰，增加了内质网压力，引起细胞合成MHC-I、CD80等分子N-糖基化修饰改变，导致不能正常折叠，无法表达到细胞表面，影响到特异性CTL的免疫识别。同时未N-糖基化修饰的MHC-I、CD80分子因无法表达，在胞内聚积。

研究病毒抗原蛋白糖基化的技术难点是如何控制糖基化修饰的发生，以往研究HBV等病毒抗原糖基化，主要依赖糖肽合成技术，该方法合成的糖肽糖基只能是寡糖，不能反映宿主细胞内病毒抗原糖基化的全貌，只适用局部表位修饰研究，不适用于连有N-聚糖的完整糖蛋白的研究。最近Lee

等[5]成功构建了包含信号肽、合成前序列和内肽酶KEX2切除位点（-Lys-Arg-）的 Pre-S重组表达载体质粒pIL20-HBVS（见 图2），该重组质粒转染酵母出现分别表达野

生型Pre-S抗原和Pre-S1°S2（Asn15Gln突变）、 Pre-S1°S2°（和糖基化位点突变抗原的菌株，可分别表达不同N-糖基化修饰的Pre-S抗原N-糖基化提供重要研究手段。

本研究拟在pIL20-HBVS质粒基础上，观察HBV Pre-S抗原表达及N-糖基化对转染细胞MHC-I、CD80N-糖基化修饰及表达的影响，并且观察HBV特异性CTL对不同HBV

图2。HBV Pre-S重组表达系统示意图

参 考 文 献

1. 2. Saccharomyces cerevisiae. Biochem 3. 2001,291:2370-2376

4. Vlad AM, Muller S, Cudic M，et al. Complex carbohydrates are not removed during processing of glycoproteins by dendritic cells: processing of tumor antigen MUC1 glycopeptides for presentation to major histocompatibility complex class II-restricted T cells. J Exp Med, 2002,196(11):1435-1446

5. Tardif KD, Siddiqui A. Cell surface expression of major histocompatibility complex class I molecules is reduced in hepatitis C virus subgenomic replicon-expressing cells. J Virol, 2003,77(21):11644-11650

6. Cole KS, Steckbeck JD, Rowles JL, et al. Removal of N-linked glycosylation sites in the V1 region of simian immunodeficiency virus gp120 results in redirection of B-cell responses to V3. J Virol,

2004,78(3):1525-1539

7. Kemal KS, Foley B, Burger H, et al. HIV-1 in genital tract and plasma of women: compartmentalization of viral sequences, coreceptor usage, and glycosylation. Proc Natl Acad Sci U S A,2003,00(22):12972-12977

8. Demetriou M, Granovsky M, Quaggin S, et al. Negative regulation of T-cell activation and autoimmunity by Mgat5 N-glycosylation. Nature, 2001,409(6821):733-739

2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究目标：

比较不同N-糖基化Pre-S蛋白表达对转染细胞MHC-I、CD80饰、细胞表面表达及特异性CTL免疫识别的影响，为进一步研究HBV免疫逃避机制提供线索。

研究内容：

⑴HBV Pre-S糖蛋白真核表达载体的构建与鉴定； ⑵HBV Pre-S ⑶ Pre-S糖蛋白表达及N-

⑷不同N-糖基化Pre-S蛋白表达细胞、CD80 ⑸观察HBV特异性CTL对不同N-糖基化表达细胞的识别差异。

拟解决的关键问题

⑴ HBV Pre-S ⑵不同N-糖基化

⑶细胞、CD80分子

3、

研究方法：

⑴定向克隆技术构建不同N-糖基化Pre-S蛋白真核表达载体； ⑵细胞转染技术建立不同N-糖基化Pre-S蛋白表达Huh7细胞克隆；

⑶还原性SDS-PAGE和免疫印迹技术（immunoblotting或West blot analysis）鉴定Pre-S蛋白N-糖基化修饰及表达；

⑷报告基因实验分析MHC-I重链和CD80分子的转录水平； ⑸流式细胞技术检测细胞表面MHC-I、CD80分子表达；

⑹脉冲追踪实验（Pulse-chase experiments）提取正常折叠的MHC-I和CD80分子； ⑺挤压离心（squeeze-out centrifugation）方法提取细胞内未折叠MHC-I和CD80分子；

⑻免疫沉淀（immunoprecipitation）和还原性SDS-PAGE技术分析MHC-I、CD80分子的N-糖基化修饰；

⑼四聚体（tetramer）/流式细胞技术分析鉴定HBV特异性CTL；

⑽标准51Cr释放实验观察特异性CTL对不同N-糖基化Pre-S表达细胞的识别差异。

实验方案：

⑴不同N-糖基化 HBV Pre-SpcDNA3.1真核表达载体的多克隆位点，PCR技术鉴定；

⑵转染Huh7（HLA-A11）人肝细胞瘤细胞株，培养条件为含10%ml培养基含青霉素100U和硫酸链霉素100µg。2日后换为含⑶筛选不同N-糖基化Pre-S泳和免疫印迹技术鉴定Pre-S蛋白N-单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的抗-小鼠IgGH（）用于切除内质网和高尔基器中蛋白早期修饰糖基（

⑷报告基因实验分析转染细胞MHC-IN-糖基化Pre-S蛋白表达转染细胞克隆MHC-I重链和CD80、CD80荧光素酶报告质粒-205/+2ATG和-335BII102/+2ATGN-Pre-S蛋白表达细胞，通过观察荧光素酶活性评价MHC-I重链和CD80W6/32单克隆抗体（识别与β2微球蛋白相连、正确折叠的HLA-A、、分子）和抗-CD80单克隆抗体作为一抗，FITC标记的抗-小鼠IgG作二抗。多克隆抗体HC70重链；

（200MHC-I和CD80分子。培养基中加入35SμCi/ml4℃与W6/32及抗CD80单克隆抗体在（immunoprecipitation）反应，然后进行还原性SDS-PAGEMHC-I和CD80分子，通过改HC70和抗CD80等抗体进行免疫沉淀及还原性SDS-PAGE电泳分析。

⑺分离急性HBV感染者外周血单核细胞（PBMC），利用四聚体（用Pre-S1和Pre-S2上的CTL表位构建）技术流式细胞仪筛选鉴定HLA-A11限制特异性CTL，标准51Cr释放实验观察HBV特异性CTL对不同N-糖基化Pre-S表达细胞的识别差异，比较判断是否与MHC-I和CD80分子表达相关。

技术路线：

不同4、 本项目的特色与创新之处。

⑴研究方向针对HBV对感染细胞自身重要糖蛋白表达影响以及宿主细胞免疫识别相关分子翻译后修饰改变可能在HBV慢性感染中的作用；

⑵构建不同N-糖基化 HBV Pre-S蛋白真核表达载体并转染至人源细胞株表达，达到控制比较N-糖基化差异的目的，克服了病毒蛋白糖基化难以操控的困难。

5、 年度研究计划及预期研究结果。

年度计划：

本课题计划三年完成，年度计划如下：

2005年1月～2006年6月: HBV Pre-S蛋白真核表达载体的构建与鉴定

2005年7月～2005年12月：转染Huh7人肝癌细胞株，鉴定Pre-S蛋白N-糖基化修饰及表达 2006年1月～2006年6月: 报告基因实验/流式细胞技术检测细胞表面MHC-I、CD80分子表达 2006年7月～2006年12月: 细胞MHC-I、CD80分子N-糖基化修饰及表达测定

2007年1月～2006年6月: 观察HBV特异性CTL对不同N-糖基化Pre-S表达细胞的识别差异

2007年7月～2006年9月 总结、评价技术指标及数据分析 2007年10月～2006年12月:评审、鉴定

预期研究成果

⑴构建出HBV Pre-S糖蛋白不同N-糖基化真核表达载体； ⑵建立HBV Pre-S糖蛋白表达细胞系；

⑶明确不同N-糖基化Pre-S蛋白表达与宿主细胞、N-糖基化修饰、细胞表面表达及特异性CTL识别的影响。 ⑷在国内外重要学术刊物发表论著4-5

（二）研究基础与工作条件

1、 工作基础

1996年“HCV包膜糖蛋白多抗原肽分子设计及阻断39670672）；1997年“HCV核心抗原T39770682）；2002年“表位糖基化修饰对应答影响及在肝损伤中作用”获国家自然科学基金资助（30200242）1996年获军队科技进步二等奖、1998年获重庆市科技进步奖二等奖。

然科学基金资助：1994年“长期人胎肝细胞培养系统用于人工肝支持的方法学研究”；2000年“人胚胎干细胞/肝细胞移植在实验性肝衰竭治疗中的应用”（30070347）、“乙型肝炎病毒(HBV)受体的探索研究”（30070691）；2001年“肝细胞对乙型肝炎病毒感染应答基因的研究”（30170847）、“抗HBV DNA多聚酶细胞内TAT-ScFv抗体的实验研究”（30100159）、“人胎肝细胞的可回复性永生化研究”（30100080）；这些研究为本项目完成奠定坚实的基础。

⑶项目申请者自1998年起开始从事HBV CTL表位糖基化研究，现承担自然科学基金项目“表位糖

基化修饰对HBV特异性/非特异性CTL应答影响及在肝损伤中作用”（30200242），项目目前进展顺利，MHC-I类分子-抗原糖肽/肽（MHC-I）四聚体构建和ELISPOT检测等实验方法均已成功建立。Pre-S上CTL表位特异性四聚体已构建成功，初步建立了抗原特异性CTL数量及功能流式细胞检测方法。并且初步获得了HBV慢性感染患者抗原特异性CTL数量及功能的研究数据和流式细胞检测细胞表面MHC-I分子表达的试验结果（见图3、图4）。

⑷申请者用计算机分子模建技术研究糖基化对CTL表位与MHC-Ⅰ类分子结合影响，发现HBV-PreS2 CTL表位152-161（SILSKTGDPV）的Ser152 O-α-GalNAc糖基化对该表位的HLA-A2结合形态影响较小，该糖肽与HLA-A2分子结合的稳定性高于未糖基化肽，糖基提供的氢键增强了该CTL表位与HLA-A2结合沟结合的亲和力及稳定性，这一改变有可能影响HLA-A2/平，引起该表位等级性改变。还发现该糖肽不仅可与HLA-A2MHC结合沟中向外伸出，可为与TCR交互作用提供了新的侧链基团，长，则不能被MHC结合沟容纳，或形成空间障碍，阻止抗原－

⑸我科为全军感染病研究所, 131张病究及生物人工肝研究居国内先进水平。对HBV、HCV、HGV了一些研究成果。细胞培养是我科的技术优势；MHC-I-ELISPOT8项国家自然科学基金资助项目其中4.霍普金斯大学感染科

pep

2、 (1) 设有2000余m2的专科实验100G净化实验室等。配有仪、罗氏Elecsys电化学发光系统、Eppendorf离心机及低温离（美国Nuare公司产品）、Milipore超纯水装置（法国Milipore心机（德国Haereus2培养箱公司产品）、包括自动摄影装置（日本Olympass公司）和显微图象处理系统、Bio-Rad-80℃冰箱（美国Nuare公司及日本Sanyo公司产品）、冷冻干燥机、低温冰箱、高压电泳仪、紫外分光光度计、全自动生化分析仪、酶标仪、等重要设备，有较好的实验条件。

(2)本校建立了全军医药信息地面接受站和Internet网三级接点，本室已进入中国电信网络，数据库上网具备条件。

(3)BD流式细胞仪由我校中心实验室提供。

(4)课题组成员都受过专业培训,对相关技术熟练掌握，能胜任本研究。

图3。用HLA-A11限制性HBV CTL细胞数量（见图中小框）

图4。流式细胞检测Huh7细胞表面HLA-A11分子表达的试验结果

图中曲线横坐标代表荧光强度，纵坐标代表细胞数

3、 申请人简历

周吉军（项目申请人）：研究的主要完成者，主要简历如下:

1985.9-1990.7在第三军医大学学习、本科，获学士学位；1992.8-1995.7在第三军医大学攻读流行病学硕士、并获硕士学位；1995.9-2002.7在第三军医大学全军感染病研究所任讲师；1996.8-1999.7：在第三军医大学传染病专业博士研究生，获博士学位；2002.7-现在第三军医大学全军感染病研究所任副教授。

硕士研究生期间主要从事医院感染防治研究，所参与的该研究获1997年军队科技进步二等奖；博士期间主要从事从事HBV表面蛋白糖基化方法及糖肽计算机分子模建等研究。第一作者发表论文22篇共参编专著4部。近年来已发表的和待发表的相关主要文章有：

1.

周吉军，王祥智，吴玉章，等. O-. 第三军医大学学报,

2000, 22（10）：958-960

2. 997-1003

3.

周吉军，吴玉章，王祥智，等. O-糖基化, 第周吉军，吴玉章. 蛋白糖基化与细胞毒性T淋巴细胞应答. （10）：

三军医大学学报, 2000, 22（10）：961-964

4.

周吉军，王祥智，吴玉章，等. 一种新Pre-S2. 第三军医大学学报,

2000,22（10）：965-968

5.

CTL epitope on HBV Pre-S2. Glycobiology，

6. 7. 234-259

8. 9. 10. 11. 3：43-46

12.

周吉军. . 中华流行病学杂志, 1997, 18（4）：199 周吉军. . 感染病学新进展. 人民卫生出版社 2001：324-342 周吉军. . . 人民卫生出版社 2001：691-704 . , 1997, 7（8）：162

T抗原识别在乙型肝炎中的作用. 中华临床医学新进展 1999；周吉军. . 人民卫生出版社 2001：72-109

周吉军. 蛋白糖基化与细胞毒性感染病学新进展. 人民卫生出版社 2001：

博士学位论文名称：表位糖基化、分子模建及糖肽免疫学活性初步研究 导师： 顾长海教授，第三军医大学西南医院解放军感染病研究所

吴玉章教授，第三军医大学基础部解放军免疫研究所

李俊刚（主要成员）：助理研究员，1999.7 第三军医大学医学检验系本科毕业；2003年在 第三军医大学获感染病学专业硕士学位。导师：王宇明教授，第三军医大学全军感染病研究所所长。1999.8至今一直在第三军医大学附一院全军感染病研究所实验室工作；在本项目中主要承担真核细胞转染载体构建和鉴定。近期发表和待刊的与本项目有关的文章有：

1．李俊刚，陈耀凯，王宇明. SV40T外显子的拼接及逆转录病毒载体pLLTSN的构建。世界华人消化杂志，2004（排印中）

2．李俊刚， 陈耀凯. 生物人工肝细胞材料研究进展. 世界华人消化杂志，2002，10(6): 699-701 3．陈耀凯，王宇明，李俊刚等. 大鼠肝卵圆细胞的形态学及免疫组织化学特征研究. 中华实验外科杂志，2003，20(1): 85

汤 勃 （主要成员）：主治医师，1995年第四军医大学军医系本科毕业，1998年获第四军医大学传染病学专业硕士学位，2003年第三军医大学全军感染病研究所博士毕业。现为本校传染病学专业博士后研究生。在本项目中主要承担细胞转染工作。近期发表和待刊的与本项目有关的文章有：

1．汤勃、王宇明、王方、刘俊、张瑞. . 《中华肝脏病杂志》, 2004, 12(1):21-24

2．汤勃、王宇明、王方、刘俊、张瑞，改良聚合酶链反应检测HBV.《中华实验与临床病毒学》, 2004,18(3),

3感染相关基因. 《中华肝脏病杂志》, 2004,12(4)

王 洪（主要成员）: 1989年7月第三军医大学传染病专业硕士毕业，2002年7

王 方（主要成员）：主治医师，19931996年在兰州医学2000-2-036/5。现为本所博士研究生。在本项目中主要承担细胞移植。

近期发表文章有：

1．，4）775-778

2. 兰州医学院学报，2000，26（3）：8－10 3.中国药理学与毒理学杂志，1999，13（4）：285－287

蒋 黎（主要成员）年毕业于华西科大学临床医学系，获学士学位，2003年在第三军医大学获医学硕士学位。现为本研究所讲师。在本项目中主要承担免疫沉淀技术工作。相关论文有：

1.蒋黎，毛青，王宇明，等. HBV感染的人鼠嵌合肝动物模型的建立.第三军医大学学报，2003；25（5）：2

2.蒋黎，毛青.人鼠嵌合肝 —— 研究肝脏病学新工具.国外医学传染病学与流行病学分册，2002；29（4）：197-200

刘 俊（主要成员）：1998年第三军医大学检验系大专毕业，2001年获学士学位。现为本研究所硕士研究生。1998年至今一直在感染病研究所实验室工作，长期从事细胞培养，积累了丰富的经验，曾参

与多项有关细胞培养的国家自然基金研究：“肝小叶型生物反应器的初步研究”(39970214)，“新一代杂交型生物人工肝的构建与自动控制”(30027001)。在本项目中主要承担细胞培养工作。发表文章：

1．刘俊，王英杰、王宇明. 分离肝细胞纯化培养方法的比较研究. 消化外科，2003，2（5）：318-321 2．刘俊，王英杰、王宇明. 分离肝细胞的超低温保存. 第三军医大学学报，2001，23（4）：478-488

4、 承担科研项目情况

在研课题

主持自然科学基金项目: 表位糖基化修饰对HBV特异性/非特异性CTL 项目资助号 30200242

项目目前进展顺利，MHC-I类分子-抗原糖肽/肽（MHC-Ipep法均已建立。已收集各型乙肝感染者PBMC标本56份；Pre-S CTL建立了抗原特异性CTLCTL数量及功能的研究数据和流式细胞检测细胞表面，为本项目提供了重要研究基础。