产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选

产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选

产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选

一、实验目的

1. 了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法。

2. 初步掌握菌种筛选方法设计。

二、实验原理

柠檬酸主要用于食品工业，作为酸味料广泛用于饮料、果酱、水果糖、冰淇淋等，还用于制药、化工、塑料等工业。能用于生产柠檬酸的菌种有毛霉、青霉、曲霉，其中尤以黑曲霉产生柠檬酸的能力最强，且能利用多种碳源，是生产中最常见的菌种。

黑曲霉广泛存在于自然环境中，空气、水、土壤中都有该菌存在。本实验根据野生柠檬酸发酵菌种耐酸性的特点，从土壤中分离纯化以获得柠檬酸发酵的野生菌种。

三、仪器与试剂

高压灭菌锅、恒温培养箱、干燥箱、超净工作台、恒温摇床、培养皿、三角瓶、烧杯、接种棒、试管、量筒、滤纸、酒精灯等。

四、方法与步骤

指示剂法（变色圈法）

（一） 菌种分离

平板采用察氏-多氏琼脂培养基加入0.04%溴甲酚绿：

蔗糖30g NaNO3 2g MgSO4·7H2O 0.5g

KH2PO4 1g KCl O.5g FeSO4·7H2O 0.01g

溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH自然。

土壤浸出液稀释以后，涂在上述培养基制成的平板上，于30℃培养。由于产酸，菌落周围会出现黄色变色圈。在变色圈还未互相连成一片时，测量变色圈直径（C）与菌落直径（H）之比。取C/H比例较大者，并且具有黑曲霉特征的菌落挑出接到斜面上（点接法，点接在斜面中部偏下方），筛选时要考虑菌种耐高温、抗杂菌污染及原料。

（二） 初筛

一般初筛培养基可进行如下选择和设计

（1）薯干粉直接发酵：25%薯干粉蒸煮后，用液化型淀粉酶（如枯草杆菌淀粉酶）液化，升温灭酶灭菌后，加入α-萘粉1mg/1或氯化十六烷基吡啶胺1mg/1.

（2）水解糖发酵：水解糖稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO3 2g/1,MgSO4·7H2O O.5

g/1，一氟乙酸钠50mg/1。

（3）葡萄糖母液发酵：母液稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO3 1～2g/1，一氟乙酸

钠50mg/1。

（4）糖蜜发酵：糖蜜稀释至含蔗糖150g/1，灭菌后加入30ml/1甲醇或乙醇。

将上述培养基以酶瓶50ml分装到250ml三角瓶内，灭菌后接入孢子2环，在30～33℃培养。旋转摇床达120r/min，往复摇床冲程6cm时，频率为120次/min，不中断摇瓶。

（三） 生产性能测定

发酵4～6天后，用细针头注射器抽取发酵液1ml，用0.1 mol/1NaOH滴定酸度。

产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选

产酸高者再进一步用纸层析或五溴丙酮法测定柠檬酸含量。 对含酸的黑曲霉菌种接种于斜面保存。

五、