生物工程下游技术第八章 非线性色谱原理

生物工程下游技术第八章 非线性色谱原理

第八章 非线性色谱原理及其在蛋 白质分离与纯化中的应用

生物工程下游技术第八章 非线性色谱原理

1、制备型液相色谱preparative liquid chromatography

获得高纯物质(色谱纯)的有效方法。 获得高纯物质(色谱纯)的有效方法。 半制备柱(内径8mm,长度15 半制备柱(内径8mm,长度15 ~ 30cm),一次制备量 .1~ mg; cm),一次制备量0 30cm),一次制备量0.1~1mg;

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2.制备HPLC概述— 2.制备HPLC概述—主要结构单元 制备HPLC概述输液部: 输液部:输液泵LC-6AD(适用于分析 半制备,再循环半制备) 适用于分析shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备)

分离部: 分离部:制备柱内径20~50mm,柱长50cm。 内径20~50mm,柱长50cm。 20 50cm

检测部: 检测部:检测器SPDshimadzu SPD-M10Avp

馏分部: 馏分部:馏分收集器FRCshimadzu FRC-10A

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制备HPLC概述— 制备HPLC概述—柱容量 HPLC概述色谱柱的柱容量(柱负荷) 色谱柱的柱容量(柱负荷) 色谱柱的柱容量 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 柱效时的最大进样量 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度 收集物纯度时的最大 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大 进样量； 进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下 进样量超过柱容量。 峰变宽。 降，峰变宽。 超载可提高制备效率， 超载可提高制备效率，以柱效下降一半 降低10%为宜。 10%为宜 或容量因子k降低10%为宜。

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制备HPLC概述—制备HPLC HPLC与 制备HPLC概述—制备HPLC与 HPLC概述目的 样品中特定 成分的高纯 度获取，大 度获取， 量、廉价的 制备 定性分析： 定性分析： 检测的灵敏 度 定量分析： 定量分析： 分离度、 分离度、再 现性 填料 流量

分析HPLC 分析HPLC比较 HPL流通池 联系

制备HPLC 制备HPLC

分析HPLC 分析HPLC

20μ以上 0.120μ以上 0.1最大允许流 在进行制 150ml/min 速可为 HPLC之 为佳 备HPLC之 150mL/min 前，常先 进行分析 HPLC实验 实验， HPLC实验， 一般的分析 对分析方 池的最大允 法进行优 0.0010.001化、放大 9.999ml/m 许流速仅为 3-5μ mL/min /min, 5 mL/min, 应用到制 in HPLC中 备HPLC中。 或者 10mL/min

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3. 制备型液相色谱仪制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径20~50mm,柱长50cm。 制备柱：内径20~50mm,柱长50cm。 20 mm 50cm

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基本概念 Cs=KCm Cs=KCm线性色谱: ① 线性色谱:流动相中的样品浓度(Cm)与固定相 样品浓度(Cm)与固定相 (Cm) 中的样品浓度(Cs)呈线 中的样品浓度(Cs)呈线 (Cs) 性关系. 性关系. 非

线性色谱:Cm与Cs不 ② 非线性色谱:Cm与Cs不 存在线性关系的色谱. 存在线性关系的色谱.固 定 相 流 定 相

Vs Cs

Vm 对应塔 Cm 板界面

分析色谱大多属于线性 色谱;制备色谱大多属 于非线性色谱

CS K = CM

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非线性色谱的特点1. 样品的保留值可变:非线性色谱的保留值 随样品及其浓度的不同而变化; 随样品及其浓度的不同而变化; 峰形的不对称性:不是高斯正态分布; 2. 峰形的不对称性:不是高斯正态分布; 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系: 3. 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高 增加的速率随浓度的增加而下降. 增加的速率随浓度的增加而下降.

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非线性色谱理论基础 研究对象：样品在固定相和流动相中的 研究对象：浓度处于非线性关系下， 浓度处于非线性关系下，各种实验参数对 色谱分离过程的影响，建立起柱参数、 色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶 质性质及操作条件之间的定量关系。 质性质及操作条件之间的定量关系。

首先要了解Cs与Cm之间的函数关系，也 首先要了解Cs与Cm之间的函数关系， Cs 之间的函数关系 即要研究吸附等温线及相应的吸附模型 即要研究吸附等温线及相应的吸附模型

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吸附等温线：一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时 它们在两相中浓度之间的关系。 它们在两相中浓度之间的关系。 分类：凸形、凹形、 分类：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形

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Cs 线形

凹形

Sig 峰形

tR tR

m

图8. 分布等温线类型及对色谱峰形和保留时间的影响

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它反映了溶质分子在固体表面达到饱和时生成了 单分子吸附层，随着溶质浓度的增加， 单分子吸附层，随着溶质浓度的增加，吸附等温 线的曲率逐渐减小，最后为零即达到饱和态。 线的曲率逐渐减小，最后为零即达到饱和态。

通常出现于大多数小分子化合物“拖尾” 拖尾”

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H型等温线是凸形等温线的特殊状态， 是凸形等温线的特殊状态，它代表了一类 很容易在固体表面吸附的物质， 很容易在固体表面吸附的物质，而且很容 易达到饱和， 易达到饱和，这类吸附主要是一些分子量 大的聚合物，如聚乙烯、 大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯

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凹形吸附等温线是适用于在低浓度下已吸附 的被吸附分子又能吸附在液相中的分子， 的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，从 而生成多分子吸附层的那些物质， 而生成多分子吸附层的那些物质，所以这种 吸附等温线的曲率随浓度的增加而增加。 吸附等温线的曲率随浓度的增加而增加。

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S形等温线实际上是凸形与凹形两种等温线叠 加的产物， 加的产物，它代表了被吸附的分子之间具有 很强的作用力，能

进一步吸附其他分子， 很强的作用力，能进一步吸附其他分子，而 溶质分子与固相表面的作用力相对较弱， 溶质分子与固相表面的作用力相对较弱，或 者与表面覆盖率无关。 者与表面覆盖率无关。

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?问题：各种类型等温线代表的溶质在 问题： 两相间具哪些分配特性？ 两相间具哪些分配特性？ 问题： ?问题：从吸附等温线能提供哪些非线 性色谱性质的信息？ 性色谱性质的信息？