灰枣离体叶片高效再生体系建立的研究

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河南农业大学

硕士学位论文

灰枣离体叶片高效再生体系建立的研究

姓名：喻晓敏

申请学位级别：硕士

专业：森林培育

指导教师：冯建灿

20090601

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｝ｉ，ｆ南农业人学２００９届硕：￡学位论文摘要

摘要

枣（ＺｉｚｙｐｈｕｓｊｕｊｕｂａＭｉｌｌ．）为鼠李科枣属植物，是我国第一大干果树种和最具代表性的民族果树之一。灰枣耐干旱、瘠薄和盐碱，抗干热风，结果早，是优良的鲜食和制干兼川型品种，但其也存在病虫害严重，落花落果严重等缺陷。离体叶片再生技术是果树细胞水平的诱变育种、变异筛选、嵌合体分离及基冈转移等方面的基础，目前已有氏勤小枣、沾化冬枣、骏枣、毛叶枣等十儿个品种的枣叶片再生体系建立成功，但朱见有关灰枣离体叶片再生体系建立的报道。

本论文以灰枣为试材，分别通过愈伤组织分化不定芽、直接再生不定芽、不定根分化不定芽三种途径，研究各种冈素如外植体条件、基本培养基类型、激素种类和浓度、光照条件、添加物等对灰枣不定芽再生过程的影响，优化箨种条件，以期建立一个适合灰枣的高效、稳定再生体系。主要实验结论如下：

（１）灰枣叶片愈伤组织的诱导宜选择组培苗叶片为外植体；苗笨中部叶片的愈伤组织诱导率高于苇顶部和．卜．部的叶片愈伤组织诱导率，以第３．５片深绿色，平展，人而厚的ｎＩ‘片为佳；接种前不伤叶缘、乖直于主脉横切３．５刀，与纵切和不切相比，愈伤组织诱导率可提高剑６５．４４％；接种方向对叶片愈伤组织的诱导影响不显并；暗培养可加速愈伤组织发生进徉，适宜的暗培养时间为１４ｄ。叶片愈伤组织诱导的最适培养基为１／２ＭＳ附加６－ＢＡ０．５ｍＩｇ／ｕ，２，４－Ｄ２．０ｍ∥Ｌ，ＡｇＮ０３Ｏ．５ｍｇ／Ｌ，愈伤组织诱导率可达到９６．６７％。由叶片诱导的愈伤组织，只有黄绿色，致密的愈伤组织在分化培养基上培养３代（５周转接一次，为一代）后才可分化出芽，将其切成０．５ｃｍ２人小接种’丁分化培养基，在ＭＳ附加６－ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ和ＩＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ培养基上分化率为１３．７７％，且一个愈伤组织块上只能分化出一个芽；在ＭＳ附加ＺＴ２．０ｍ∥Ｌ和ＩＢＡ０．１ｍ∥Ｌ培养基上能分化山丛生芽，分化率可达３７．３４％。

（２）ｒｒＩ’片直接再生不定芽的最适培养基为ＷＰＭ＋ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ０．５ｍｇ／Ｌ；最佳外植体为灰枣组培苗中部平展，火而厚ｎ１‘片；不定芽多在近叶柄处发生，再生率比近叶尖处高５９．７４％；以近轴面接触培养基接种较以远轴面接触培养基接种的再生率高１６．８ｌ％；提高蔗糖浓度到４０９／Ｌ可降低再生芽的玻璃化程度；适当时间的暗培养可以提高灰枣叶片再生能力，以１０ｄ的暗培养处理最佳；添加ＡｇＮ０３０．５ｍｇ／Ｌ叶片再生率可提高剑８２．２５％，平均每叶片再生芽数为２．６４个。

（３）灰枣组培苗叶片不定根诱导的最佳培养基为Ｉ／２ＭＳ附加ＮＡＡ０．３ｍｇ／ｅ和ＩＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ，诱导率为９２．９５％，诱导的不定根乳白色，粗壮。将不定根切成０．５ｃｍ的小段接种ｙ－ＷＰＭ附加ＴＤＺＩ．０ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ的分化培养基上，分化率可达４４．５１％，平均每不定根再生芽数２．０８个。．２．

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河南农业人学２００９屈顾Ｊｊ学位论文摘要

（４）将分别通过愈伤组织再生、直接再生和不定根再生三种途径诱导的不定芽接种剑继代增殖培养基ＭＳ＋６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．５ｍｇ／Ｌ，培养至３５ｄ，增殖系数为３．０６。

（５）将继代增殖的再生曲．切成２ｃｍ左右的拳段接种在生根壮苗培养基上诱导生根，最佳的生根培养基为１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ，培养４０ｄ的生根率达９５．５６％，再生茸基部仅有极少量的愈伤组织产生，发生的根粗壮，质鲑较好。

关键词灰枣，叶片，不定芽，离体再生．３．

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河南农业人学２００９届硕ｌ：学位论义英文摘要Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｌｅａｖｅｓｏｆ

Ｚｉｚｙｐｈｕｓｊｕｊｕｂａ‘Ｈｕｉｚａｏ’

Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＦｅｎｇＪｉａｎｃａｎ

ＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＹｕＸｉａｏｍｉｎ

ＡＢＳＴＲＡＣＴＪｕｊｕｂｅ（ＺｉｚｙｐｈｕｓｊｕｊｕｂａＭｉｌｌ．）ｉｓ

ａｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔａｎｄｉｎＣｈｉｎａｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｆｒｕｉｔｔｒｅｅｓｉｎＣｈｉｎａ．‘Ｈｕｉｚａｏ’ｉｓｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｖａｒｉｅｔｙｏｆｊｕｊｕｂｅ

ｔｈａｔｈａｓｔｈｅｌｏｎｇｅｓｔｐｌａｎｔｉｎｇｈｉｓｔｏｒｙ，ｔｈｅｌａｒｇｅｓｔｏｒｃｈａｒｄａｒｅａ，ａｎｄｈｉｇｈｅｓｔａｎｎｕａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｉｎｃｅ‘Ｈｕｉｚａｏ’ｈａｓｓｍａｌｌｆｌｏｗｅｒｓ，ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｅｍａｓｃｕｌａｔｉｏｎｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔ．Ｈｉｇｈｅｍｂｒｙｏａｂｏｒｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄｔｈｅｌｏｗｒａｔｅｏｆｔｈｅｆｒｕｉｔｓｅｔｉｎｔｈｉｓｐｅｒｅｎｎｉａｌｗｏｏｄｙｆｒｕｉｔｔｒｅｅｍａｋｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｑｕａｌｉｔｙｂｙｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇｑｕｉｔｅ

ｏｎｄｉｆｆｉｃｕｌｔ．Ｌｅａｖｅｓｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇｔｈｅ

ｏｎ．ｌｅｖｅｌｏｆｃｅｌｌ，ｍｕｔａｔｉｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄＳＯ

Ｆｒｏｍｔｈｅｎｏｎ，ｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｆｒｏｍｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｓｈａｖｅｂｅｅｎａｃｈｉｅｖｅｄｉｎｓｅｖｅｒａｌＺｊｕｊｕｂａｃｕｌｔｉｖａｒｓ，ｓｕｃｈａｓ‘Ｍｉｎｇｑｉｎｘｉａｚａｏ’，‘Ｚｈａｎｈｕａｄｏｎｇｚａｏ’，‘Ｊｕｎｚａｏ’ａｎｄ

ｎｏ‘Ｍａｏｙｅｚａｏ’．Ａｓｏｆｙｅｔｔｈｅｒｅｉｓｒｅｌｉａｂｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅａｐｐｌｉｃａｂｌｅｔｏ

‘Ｈｕｉｚａｏ’，ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｐｒｏｍｉｎｅｎｔｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆｊｕｊｕｂｅ．

ｊｕｊｕｂｅ，ｓｕｃｈａｓＣｒｉｔｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｌｅａｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｂａｓａｌ

ｍｅｄｉｕｍ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ，ｌｅａｆｍａｔｕｒｉｔｙ，ｌｅａｆｐｏｓｉｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｈｏｏｔ，ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ

ａｒｅｏｆｅｘｐｌａｎｔｃｏｎｔａｃｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｏｕｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｓｅｆａｃｔｏｒｓ

ａｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａｎｄｏｂｊｅｃｔｉｖｅｗａｓｔｏｏｂｔａｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｕｓｉｎｇｌｅａｆｓｅｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍ‘Ｈｕｉｚａｏ’．

ａｒｅａｓＴｈｅｍａｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓｆｏｌｌｏｗｓ：

ｓｏｕｒｃｅ（１）Ｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｎｔｌｅｔｓｗｅｒｅｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｐｌａｎｔｆｏｒｃａｌｌｕｓ

ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＺｊｕｊｕｂａ‘Ｈｕｉｚａｏ’．Ｔｈｅｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｌｅａｖｅｓｆｒｏｍｔｈｅ

ｏｎｅｓｃｅｎｔｒａｌｓｔｅｍｏｆｐｌａｎｔｌｅｔｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅ

ｐａｒｔ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｐｌａｎｔｉｓｔｈｅｌｅａｖｅｓｗｈｉｃｈｆｒｏｍｔｈｅｌｏｗｅｒｐａｒｔａｎｄｔｈｅｕｐｐｅｒａｒｅｏｎｔｈｅｔｈｒｅｅｔｏｆｉｖｅｏｆｔｈｅｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈｆｌａｔ，ｌａｒｇｅａｎｄｔｈｉｃｋ．Ｃｕｔ３－５ｋｎｉｖｅｓｖｅｒｔｉｃａｌｔｏｔｈｅｍａｉｎｖｅｉｎｎｏｔｔｏｈｕｒｔｔｈｅｌｅａｆｍａｒｇｉｎｂｅｆｏｒｅｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ

ｎｏＣａｎｂｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｏ６５．４４％ｏｎｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｐａｒａｌｌｅｌｔｏｔｈｅｍａｉｎｖｅｉｎａｎｄｃｕｔｓ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｐｌａｎｔｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ

．６５．

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河南农业人学２００９届硕Ｉ：学位论文英文摘要ｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｌｅｎｇｔｈｏｆｐｒｅ—ｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄａｒｋｎｅｓｓｃａｎａｃｃｅｌｅｒａｔｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃａｌｌｕｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｔｉｍｅｉｎｄａｒｋｎｅｓｓｉｓ１４ｄａｙｓ．ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｉｓＩ／２ＭＳｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡａｎｄ２．０ｍｇ／Ｌ２，４一Ｄ，０．５ｍｇ／ＬＡｇＮ０３，ｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙＣａｎａｃｈｉｅｖｅｔｏ

ｏｎ９６．６７％．Ｏｎｌｙｔｈｅｙｅｌｌｏｗ－ｇｒｅｅｎ，ｄｅｎｓｅｃａｌｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ

３ｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ｔｈｅｎｉｎｃｕｂａｔｅｔｈｅＣａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｈｏｏｔｓ．ＣｕｔｔｈｅｍｉｎｔｏＯ．５ｃｍ２ｓｉｚｅａｎｄｏｎｏｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｃａｌｌｕｓ

ｏｎｅＭＳｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ６－ＢＡ３．０ｍｇ／ＬａｎｄＩＢＡ０．２ｍｇ／Ｌｉｓ１３．７７％，ａｎｄｃａｌｌｕｓ

Ｃａｎｏｎｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｏｎｅｓｈｏｏｔ．ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｃａｌｌｕｓｏｎＭＳｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈＺＴ２．０ｍｇ／ＬａｎｄＩＢＡ０．１ｍｇ／Ｌｗａｓ３７．３４％．

（２）ＷＰＭｗｉｔｈＯ．５ｍｇ／ＬＴＤＺｐｌｕｓ０．２ｍｇ／ＬＮＡＡｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｆｏｒｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔ

ｏｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ‘Ｈｕｉｚａｏ’．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｐｌａｎｔｉｓｔｈｅｙｏｕｎｇｌｅａｖｅｓ

ｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈａｒｅｔｈｅｍｉｄｄｌｅｏｆｔｈｅｆｌａｔ，ｌａｒｇｅａｎｄｔｈｉｃｋ．Ｗｈｉｌｅｍｏｒｅａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓｉｎｉｔｉａｌｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ

ｃａｐａｃｉｔｙａｔｔｈｅｐｅｔｉｏｌｅｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｄｒｉｂａｎｄｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇａｒｅａ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

ｉｎｃｒｅａｓｅｄ５９．７４％ｆｒｏｍｔｈｅｔｉｐｔｏｗａｒｄｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｔｈｅｌｅａｆ．Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ‘Ｈｕｉｚａｏ’ｗａｓ１６．８１％ｈｉｇｈｅｒｗｈｅｎｔｈｅａｄａｘｉａｌｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｅｘｐｌａｎｔｓｗａｓｉｎｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅａｂａｘｉａｌｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｅｘｐｌａｎｔｓｗａｓｉｎｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈｔｈｅｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｃｒｏｓｅｉｎ４０９／ＬＣａｎ

ｃａｎｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｈｙｐｅｒｈｙｄｒｉｃｄｅｇｒｅｅｏｆａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓ．Ａ１０－ｄａｙｄａｒｋｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ

ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ１４．１４％ｗｉｔｈｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆ０．５ｍｇ／ＬＡｇＮ０３ｔｏｔｈｅｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｓｈｏｏｔｓｐｅｒｅｘｐｌａｎｔ

ｗｉｔｈｏｕｔＡｇＮ０３．ｃａｎｒｅａｃｈｔｏ２．６４ｐｉｅｃｅｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ

（３）１／２ＭＳｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈＯ．３ｍｇ／ＬＮＡＡａｎｄ２．０ｍｇ／ＬＩＢＡｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｆｏｒａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｏｆ‘Ｈｕｉｚａｏ’，ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｃａｎｒｅａｃｈｔｏ９２．９５％，ｔｈｅａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ

０．５ｃｍ，ｔｈｅｎｉｎｏｃｕｌａｔｅｏｎｒｏｏｔｓｉｎｄｕｃｅｄａｒｅｗｈｉｔｅ，ｔｈｉｃｋ．ＣｕｔａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｓｉｎｔｏＷＰＭｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ１．Ｏｍｇ／ＬＴＤＺａｎｄＯ．２ｍｇ／ＬＮＡＡ，

ｒｅａｃｈｔｏ４４．５１％．ａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ

ｂｕｄｓｗｅｒｅ２．０８ｐｉｅｃｅ．ｃａｎ

（４）ＩｎｏｃｕｌａｔｅｔｈｅａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｒｅｅｗａｙｓａｂｏｖｅｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎＭＳｐｌｕｓ２．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ，Ｏ．５ｍｇ／ＬＩＢＡａｎｄＯ．５ｍｇ／ＬＫＴ，．６６．．

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＿｝ｌⅡ南农业人学２００９届硕ｌｊ学位论文英义摘要ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３５ｄａｙｓ，ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｗｅｒｅａｂｏｕｔ３．０．

（５）Ｃｕｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓｉｎｔｏ２．０ｃｍ，ｔｈｅｎｉｎｏｃｕｌａｔｅｏｎｔｈｅｒｏｏｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅｂｅｓｔｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍｗａｓ１／２ＭＳｐｌｕｓ０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ．Ａｆｔｅｒ

ｃａｌｌ４０ｄａｙｓｃｕｌｔｕｒｅ，ｒｏｏｔｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｃｅａｃｈｉｅｖｅｔｏ９５．５６％．Ｏｎｌｙ

ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｓｍａｌｌｎｕｍｂｅｒｏｆｃａｌｌｕｓａｔｔｈｅｂａｓｅｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｌｅｔ，ｔｈｅｏｆｔｈｅｒｏｏｔｗｅｒｅｔｈｉｃｋ，ｈａｄｇｏｏｄ

ｑｕａｌｉｔｙ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＺ．ｊｕｊｕｂａ‘Ｈｕｉｚａｏ’，ｌｅａｖｅｓ，ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓ，／ｎｖｉｔｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．６７．

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河南农业人学２００９届硕Ｉ：学位论文缩略测表缩略词表

２，４…Ｄ一２，４一Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ…２，４－二氯苯氧乙酸；

６－ＢＡ一６－Ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ…－６苄基氨基嘌呤：

ＡＣ…Ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｒｂｏｎ…活性碳：

ＡｇＮ０３一ＳｉｌｖｅｒＮｉｔｒａｔｅ…硝酸银：

ＧＡ３…Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃａｃｉｄ…赤霉素；

ＩＡＡ…Ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ…吲哚乙酸：

ＩＢＡ…Ｉｎｄｏｌｅ一３－ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ一吲哚．ｊ．酸：

ＫＴ—Ｋｉｎｅｔｉｎ…激动素：

ＭＳ…ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ…ＭＳ培养基；

ＮＡＡ…Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ—ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ…萘乙酸：

ＴＤＺ…Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ…噻苯隆：

ＷＰＭ…Ｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｍｅｄｉｕｍ…木本植物培养基；ＺＴ…Ｚｅａｔｉｎ…玉米素．

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河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论

文题目

学生

姓名

学位论文

是否保密灰枣离体叶片高效再生体系建立的研究喻晓敏否学位级别导师姓名年硕士冯建灿教授月日学科专业森林培育如需保密，解密时间

独创性声明

本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我－ＭＩ作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。

研究生签名：禽瞧扇文豫厶导师签名：ｚ垄厂二≯厶日期：加１年６。月Ｉｏ日日期：砂叶年多月厶日

学位论文使用授权及知识产权归属承诺

本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学昕右不Ｇｉｌｌ否士日妇内的注猹軎肛

研究生签名：嘶泓导师签名：７班

日期：劢。了年Ｚ月ｌｏ日日期：锄中年‘月ｆ口日学院领导签名：ｌ叩松日期：加ｎ年Ｉ｜ｎ月ｌｏ日

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致谢

本论文从选题、实验、写作到最后的成稿，都是在导师冯建灿教授的精心指导下完成的。三年来，冯建灿教授用他渊博的学识，严谨的治学态度和一丝不苟的工作作风指导我，使我学到了如何对待学习和工作；更是以他严于律己，宽以待人的人格魅力影响着我，让我懂得如何对待生活，使我深省，催我奋进。在此，谨向导师冯建灿教授致以崇高的敬意和衷心的感谢！

感谢林学园艺学院刘震教授、范国强教授、茹广欣教授以及李继东老师、武应霞老师、毕会涛老师三年来在我学习上的指导和帮助，感谢校院各级主管研究生工作的老师们的辛勤劳动，他们的关心和支持使我三年的学习生活井然有序，充实圆满。

感谢郑州农林科学研究所王慧瑜老师、张晓申老师对试验提供的支持和帮助；感谢师姐尚霄丽、师弟邢东方、梁启伟、师妹马春华在我试验过程中的无私帮助；感谢男友李世升对我生活的关心和工作的支持。同时还要感谢研究生班的李晨、贺丹、刘广霞、屠琼芳、齐飞艳、朱平乐、阚盛、赵俊勇、菅广宇、董占强等同学，三年真挚的同学之情是我终身难忘的财富。

在此，我还要郑重的向我的父母表示深深的敬意，感谢父母多年的养育之恩和一直以来无私的关怀、理解和支持。

感谢所有关心帮助我的亲人和朋友！

喻晓敏２００９年６月

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河南农业人学２００９届硕一Ｊ：学位论文第一章文献综述

第一章文献综述

１枣资源概况

１．１枣的起源

枣树是我国最古老的果树之一。众多的植物学家认为，枣树起源中国。在距今８０００年前的河南新郑裴李岗新彳ｉ器时代的遗址中，就曾发现过枣的遗物。最古的文献记载是《夏小止》、《周礼》和《诗经》。《诗经》中说：“八月剥枣，十月获稻”（陈９ｌｆ７金，１９９１）。可见，远在２５００年前的周代，收枣种稻已成为重要的农业活动。此外在秦汉时代的古墓中以枣作为陪葬品的事也屡见不鲜。这都说明我国利用枣，栽培枣的历史至少在３０００年以上（曲泽洲，１９８７）。曲泽洲（１９８９）等通过对出十的炭化枣核、叶化Ｚ凡古文献及古枣树和古酸枣树的考证，结合对枣和酸枣现有分布等的综合分析，认为黄河中－卜．游带是枣的原产地利最早的栽培中心，国外的枣树都是直接或间接从我国引进的。

１．２枣的分布及栽培现状

枣在我国分布Ｊ“泛，根据我国气候、－十壤、品种特点和现有栽培情况，把我国枣划分为两人生态栽培区，即北枣和南枣两个生态栽培区。北方栽培区，土要集中分布在山尔、河北、山两、陕西、河南五省，该枣产区枣树品种资源丰富，类型复杂，果实干物质多，含糖鼙高，适于于制；南方栽培区位丁秦岭、淮河以南，包括湘、鄂、浙、苏、川、闽等省。南方产区十壤多．警酸性雨ｌ微本能性，枣晶种数量较少，品质一般不如北方，多刚丁．加ｌ：蜜枣或鲜食。全国枣树栽培品种主要集中在北方五省，约Ｉ‘１－枣树品种的７３％，产鼙１１１．全国总产量的７５％一９０％（李新岗，１９９８：吴臻，２００２）。

１．３枣的常规繁殖方式

枣树栽培繁殖作为枣树研究的主攻方向是近儿年我国枣树栽培面积迅速扩展的主要原因，选择出优良的地区品种和提高优质丰产技术在枣树生产中１卜常重要。枣树育苗方法有分孽繁殖法、嫁接法、扦插法和组织培养法育苗，少数采用实生繁殖（孙浩元，２００１；毛静琴，２０００；何振艳，２００１；段乃彬，２００２；陈宗礼，２００２；干忠，２００２）。

分孽繁殖是利川枣树根系容易形成不定芽长成新株的特性，采川一定的方法刺激根系产生不定芽，形成根孽苗，从而形成新株的繁殖方法；但其缺点是繁殖系数低，根系差，栽植成活率低。嫩枝扦插育苗是利用枣树的幼嫩枝条容易产生不定根的原理培育繁殖新植株的方法。枣树是扦插难生根树种，张淑莲（１９９４）研究发现，枣树韧皮部的；＇ｔ－Ｎ皮层薄颦组织之间，有一条带状ｆｔ｝Ｙ０成束的厚壁组织（该组织主要由纤维细胞组成），对不定根的形成有一定的障碍。为提高扦插成活率，必须采取相应措施，如给接穗生根提供适宜的温度和湿度等外部条什，并通过激素处理改善插条内部生长素比例。郑先武（１９９５）研究认为外源激素洲ＡＡ）通过影响插穗内部的生理生化反应，来促进金丝小枣扦插生根；张汉元（１９８８）试验认为：经１００ｐｐｍｌＢＡ处理的枣树嫩枝（１２—１５ｃｍ，带芽２—３个），６月中旬插在珍珠岩基质上成活率最．４．

组织培养

河南农业人学２００９届硕Ｉ：学位论义第一章文献综述高达９０％；来锡福（１９９５）川当年生半术质化枣头发育枝做打插材料，以河沙做扦插基质，用塑料小拱棚和人：Ｉ：洒水调控温湿度，打插成活率达８５％以上；刘国兴（１９８９）认为６月－卜．旬一８月中旬是枣树绿枝扦插生根率最高时期，平均生根率可达８６％以上，不川激素处理也可达７０％；嫁接是目前枣树栽培育苗中常朋的方法，包括劈接、切接、腹接、插皮接、芽接等，嫁接苗能够保持品种优良特性，根系发达，方法简便易行；但扦插和嫁接的栽植成活率都比较低，全光喷雾技术和生长素在扦插和嫁接上的应用，虽然使成活率大火提高，但繁殖系数依然较低且不能进行周年生产，远远不能满足生产上的人鼍需求，势必延误很女，的市场机会，同时使新品种的推Ｊ’－受剑极人的限制（千忠，２００２；史俊燕，２００２）。另外，在枣树中存在一种病毒性病害一枣疯病，能使枣树终生绝产，而分孽繁殖及嫁接的伤口是传播此病的主要途径，并且传统的无性繁殖措施也无法去除幼苗体内的病毒，造成其代代相传，危害日益严重的局面。实生繁殖土要用丁．砧小繁殖及新品种的选育，具有特殊意义，还能消除枣疯病的发生，但是很多栽培品种枣的种子发芽率在１０％以下。这些缺点都极人的限制了优良枣树品种的推Ｊ“及人规模利州（田砚亭，１９９３）。现代生物技术的发展为枣树良种的快速繁殖提供了一条出路，目前只有组织培养是能在短期内迅速人耸繁殖的唯一方法，也是唯一可以彻底去除母体内病毒的方法（＿千宁，２００ｌ：钟宁，２００２）。

２枣树组织培养研究进展

小本植物组织培养再生途径有二种（许智宏，１９８８）：（１）无菌短枝扦插（ｓｔｅｒｉｋ

ｃｕｔｔｉｎｇ），（２）器官发生（ｏｒｇａｎｏｇｅｎｓｉｓ），（３）体细胞胚发生（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）。ｓｈｏｏｔ

２．１无菌短枝扦插途径

无凶短枝扦插是采用一个有活力的潜伏芽在无菌条件下扦插，使其长出芽或产生丛生芽，进一步诱导生根形成完整植株的过程。它是川组织培养法进行无性繁殖方面应用最Ｊ＇．泛的方法，开展得最早且最成功。一般选川拳尖、带腋芽苹段、幼嫩的枣头芽，也可选圳休眠枝或根蘖条，经灭菌后由原来的腋芽或枣头芽继续萌发出芽。到２００７年底，已经有鸣山人枣、金丝小枣、黑山晋枣、Ｌ心勤小枣、桐桕人枣、苹果枣、酸枣、临泽小枣、梨枣、狗头枣、骏枣、掉牙枣、毛叶枣、赞皇人枣、沾化冬枣、辣椒枣、木枣、泗洪人枣、尜尜枣等２０多个品种通过无凶短枝扦插途径建立了组培快繁无性系（表１）。

表Ｉ１９９０—２００７年枣无性系建立品种名录

ＴａｂｌｅｌＳｐｅｃｉｅｓｄｉｒｅｃｔｏｒｙｏｆｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｃｌｏｎｅｏｆＪｕｊｕｂｅｆｒｏｍＩ９９０ｔｏ２００７

品种

鸣山大枣

金丝小枣

鸣山大枣

临泽小枣

金丝小枣

黑山晋枣外植体试管苗带主芽茎段大田茎段试管苗茎段试管苗茎段根蘖条水培抽出的嫩芽带腋芽茎段作者（时间）王嘉长１９９０严仁玲１９９０张福泉１９９５金芳１９９６罗晓芳１９９６刘翠云１９９７

组织培养

河南农业人学２００９屈硕十学位论文第一章文献综述２．２器官发生途径

器官发生途径是指离体植物组织（外植体）或细胞（悬浮培养的细胞和原生质体）在组织培养的条件卜．形成完整植株的过科，是组培再生的土要途径。当芽是从那些本不该产生芽的部位（如叶片、子叶）上诱导出时，这种芽称为不定芽；而当芽是从通常会产生芽的部位上再生山时，这种芽称为侧芽和腋芽。器官发生途径与无菌短枝打插途径都需要经过相互分开的芽诱导期和根诱导期，但两者的本质｜又：别在于植物体的细胞是否经过脱分化和再分化过程。

从发生过程来看，枣树器官发生包括直接的器官发生和间接的器官发生两种途径。直接器官发生是指不经过愈伤组织阶段，直接从原始外植体上诱导产生不定芽或不定根的过程。间接器官发生是指先从外植体上诱导出愈伤组织，再从愈伤组织上诱导山不定芽或不定根原基的过程。从发生再生植株的材料来看，枣树器官发生包括愈伤组织培养，胚胎培养，花药培养，原生质体培养等。．６．

组织培养

ｉｉ，Ｉｉ萄农业人学２００９届顾．Ｉ：学位论文第一章义献综述２．２．Ｉ愈伤组织培养

营养器官通过离体培养一般先由外植体脱分化产生愈伤组织，愈伤组织再生系统的建立是细胞培养、原生质体培养及遗传转化等研究Ｉ：作的基础。

叶片、花药、胚、芽，等都可以作为诱导愈伤组织的外植体，外植体年龄不同，其组织结构、细胞分化和生理状态等方面也存在著异，对诱导培养有一定影响。何业华等（１９９７）分别对灌田Ｉ艮枣、普通枣和中南林优ｌ号的幼叶、嫩枝、芽和花蕾进行了愈伤组织的诱导，研究发现芽、蕾、朱展开的幼ｎ１＋、嫩枝顶部和胚愈伤率均达１００％，胚所产生的愈伤组织最多，其次是嫩枝顶部和芽，而花蕾和幼叶愈伤组织形成则较少，但随着攀、ｎｌ。发育稃度的增加，愈伤率则迅速降低，离苇顶８—１２ｍｍ举段和展ｎｌ。后的ｎｌ‘尖愈伤率分别卜．降３５％禾Ｉ８０％。此结果表明：同一器官，分化科度越高，产生愈伤组织的能力越低。冈此，在诱导愈伤组织时，应根据不同种类的材料选择不同的部位及不同的发育时期。

培养基的基本成分对愈伤组织的形成也有影响。何业华等（１９９８）就枣树愈伤组织不定芽的分化条件进行了探讨，发现只有生长率在１００％一１５０％，结构仍保持紧密、正面绿色的胚性愈伤组织，才会有许多瘤状突起，进一步发育形成不定芽。激素的种类、绝对含域及生Ｋ素／细胞分裂素的比值是影响枣树愈伤组织不定芽分化的重要冈素，只有在ＮＡＡ０．０１５ｍｇ／１＋ｚＴ１．７５ｍｇ／ｌ＋ＫＴ４．０ｍｇ／ｌ的组合中才能获得较高的再生频率。添加２．０ｍｇ／！的ＡｇＮ０３后，能显并抑制愈伤组织褐化。陈宗礼等（２００２）以沾化冬枣叶片为外植体，诱导了愈伤组织的产生，但愈伤组织分化率仅为４０％。伍成厚等（２００４）对枣树愈伤组织进行了继代培养和不定芽诱导的研究，结果表明：举段诱导的枣树愈伤组织在激素浓度为ＮＡＡ３．０ｍｇ，Ｌ＋ＺＴ２．０ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基中继代培养４次后能够诱导不定芽分化。另外，培养条１ｊ，Ｉ：对愈伤组织的诱导也有影响。孙清荣等（２００２）以酸枣ｎ１’片为外植体，研究表明，将叶片置丁．黑暗中培养３周，然后再移入光照卜．培养，愈伤组织质量较好，能显著提高芽的诱导率。以上研究表明暗处理可以促进愈伤组织发生。

２．２．２胚培养

枣树繁殖通常不采川常规的播种方法，冈为种子不山苗或萌发率很低。常川的嫁接繁殖法不能解决育种的问题，通过白发突变选育品种成功的概率义很低。杂交育种是育种技术中最常用、最有效的方法之一，但由丁枣中将遍存在着胚发育不良或中途败育而不能获得种子或种子难以萌发，严重影响枣常规杂交育种的止常进行。胚培养是对种胚进行人．Ｉ：离体培养的技术，该技术可克服胚的败育，缩短选育时间，提高常规杂种优辨育种的效率。胚培养的成功与否，关键在丁采接时期的选择。成熟胚在无激素的培养基上即可Ｋ成幼苗，幼胚生Ｋ往往需要较复杂的培养基。

目前在枣树方面只有胚珠培养和以合子胚的部分（胚轴和子叶）为外植体诱导器官发生的报道。刘贵，ｆ：等（１９８８）对金丝小枣进行胚珠培养，并获得小植株；马均（２００１）以枣胚轴为外植体，在ＭＳ（Ｉ／２Ｎ０３。）＋１．７５ｍｇ，ＬＺＴ＋０．０１５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋４ｍｇ，ＬＫＴ＋２ｍｇ／ＬＡｇＮ０３和．７．

组织培养

河南农业人学２００９届硕一Ｉ：学位论文第一章文献综述ＭＳ＋Ｏ．５ｍｇ／ＬＩＢＡ两种培养基上成曲率都达４０％。段乃彬（２００２）等对影响枣树胚离体培养的３个冈素：取材时期、激素配方及光照条件进行研究的结果表明：发育早期较为幼嫩的胚，主要的培养产物是绿色或黄色的愈伤组织及胚状体，不能直接发育为小植株。成熟胚萌发率较高，添加外源激素起抑制作州。不能诱导产生愈伤组织及胚状体。光照可以明显的诱导胚萌发，而且这种诱导作州主要在培养的初期。祁业风（２００４）等以冬枣、金丝丰等为试材，对坐果后１０—７０ｄ幼胚进行培养，结果表明，枣离体胚接种后土要有３种生长方式，即形成愈伤组织、子叶间小叶增生利胚直接萌发成苗。杜学梅等（２００５）建立了枣胚培养的再生体系，发现适宜胚挽救的最小胚龄为花后５０ｄ左右：花后７０—７２ｄ胚龄的胚适宜培养基为ｌ／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．４ｍｇ／Ｌ＋ＢＡ０．８ｍｇ／Ｌ＋ＬＨ５００ｍｇ／Ｌ＋ＧＡ３５ｍｇ／Ｌ＋５％蔗糖，胚培苗经扩繁后转入Ｉ／２ＭＳ＋ＩＢＡｌ．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ０．０６ｍｇ／Ｌ＋２％蔗糖培养基上，获得了健壮生根苗。

枣树的胚败育现象１Ｆ常普遍，通过人工杂交获得的杂种胚更是冈严重败育而雉以获得杂种苗。阐明败育机理、找剑延缓胚败育及对早ｊｍ幼胚进行挽救的方法平¨手段，已成为一个迫切需要解决的问题。

２．２．３胚乳培养

剑目前为ｌ卜，枣胚乳培养只有，ｆｉ荫坪等有过报道。胚乳是舣受精产物，是天然的三倍体结构。通过胚乳培养获得再生植株，有望建立起二倍体新植株。枣胚乳属核型，发育过程分游离核、细胞形成和细胞急骤解体３个时期。１９７８一１９８０年，彳ｉ荫坪等（１９８５）在山尔泰安对中国枣的长红、圆铃、金丝小枣等品种进行胚乳培养，已首次育成２ｎ＝３ｘ＝３６的完整植株，为枣属植物增添了新的种质资源。分期接种实验表明，胚乳细胞形成时期为适宜接种期。以此时期的胚乳为材料、ＭＳ为基本培养基，无论单独使川２，４．Ｄ，还是与其他生长素或细胞分裂素相配合或单独使川蜕皮素，均可诱导出胚状体。将胚状体转人低糖、无激素的Ｉ／２ＭＳ培养基，增加光照，经多次继代，可得到无根苗。再川附加ＩＢＡ的１／２ＭＳ培养基诱导生根即可得到完整植株（彳ｉ荫坪，１９８５）。

２．２．４花药培养

在单倍体品种的选育途径中，花约培养的成就最为显著。花药培养诱导单倍体，再经染色体加倍形成纯合二倍体，可以缩短获得纯系的时间，便丁研究遗传规律，提高选育效率。我国通过花药培养选育山的作物新品种与新品系己经超过２０个（＿干红梅，２００３）。然而，枣的花药培养报道较少。Ｉ于震星等（１９９６）刚了３年时间对金丝小枣的花约进行培养，诱导产生了愈伤组织并获得了再生试管小苗。在培养过程中发现，以５月中旬至５月下旬采集的花药较易获得愈伤坌ｆｌ织，且低温预处理可以提高金丝小枣花约愈伤组织诱导率，６－ＢＡ是愈伤组织分化小植株的决定｜灭｜素，最适浓度为１．５—２．０ｍｇ／Ｌ，同Ｏ．４—０．８ｍｇ／ＬＩＢＡ配合时效果最佳。但金丝小枣的花约愈伤组织培养存在倍性突变的问题，在同一块愈伤组织上存在有单倍体细胞、二倍体、二倍体、四倍体细胞，对愈伤组织形成的小植株镜检，结果表明人部分为二倍体，单倍体比率较低（王震星，１９９６）。李登科等（２００３）对６月鲜枣冷藏５ｄ后的．８．

组织培养

河南农业人学２００９屈顾Ｉ：学位论义第一章文献综述花约进行了培养，较适宜的培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖６％。花药培养过程中，需要在单倍体细胞的分离、扩人繁殖、试管曲分化等问题上进行更深入的研究。

２．２．５原生质体培养及融合

原生质体培养是体细胞尔交和基冈转化的基础，为创造新植物开辟了广阔的廊川前景。起始材料、纤维素酶浓度平¨酶解时间是影响原生质体分离的重要冈素；在原生质体分离技术成熟后，培养基成为影响原生质体培养成功的关键冈素。

枣树原生质体培养开始－ｊ－．１９９９年，国内外关于枣原生质体培养的研究报道较少。何业华等（１９９９）以无核小枣为试材，川胚性悬浮培养细胞、细粒状胚性愈伤组织、朱细切愈伤组织和己细切愈伤组织等４种材料进行原生质体分离，结果表明，胚性悬浮培养细胞是最佳起始材料，再以无核小枣和鸡蛋枣的芽胚性悬浮细胞为材料，成功获得了完整的原生质体再生植株。用浓度为１０∥Ｌ纤维素酶＋ｌ∥Ｌ离析酶＋ＣＰＷ盐＋０．７ｍｏｌ／Ｌ甘露醇组成的混合酶液对起始材料进行１６ｈ的酶解，可获得较高的原生质体产量，且原生质体活力较高；然后采用不同种类的培养基不同含鲑的组合及不同原生质体密度进行原生质体培养，采用ＫＭＳｐ作培养基，附加ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ＋ＺＴ０．２ｍｇ／Ｌ的激素组合，以５×１０５个原生质体／ｍｌ的培养密度，对其原生质体经１０周液体浅层培养，可获得直径约为１ｍｍ的微愈伤组织，然后将其先后转入低渗ＫＭ８ｐ＋ＮＡＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＺＴ０．２ｍｇ／Ｌ和ＭＳ（Ｉ／２Ｎ０３）＋ＮＡＡ３．０ｍｅｄＬ＋ＺＴ２．０ｍｇ／Ｌ弼种｜匍体培养基上增殖，再转入枣分化培养基中，可获得完整的原生质体再生植株。

原生质体通过体细胞融合而获得体细胞杂种，从而有效克服远缘杂交上的障碍，扩人亲本组合范围，综合不同物种的遗传信息，丰富现有种质资源。赵维峰（２００５）分离得剑了毛叶枣和冬枣的原生质体，在交变电场强度为１００Ｖ／ｃｍ、交变电场作刖时间５０ｓ、直流脉冲强度１０００Ｖ／ｃｍ、直流脉冲时间５０螂的条件卜．，枣树原生质体融合效果较好。冬枣与毛叶枣的融合比例为１：２，融合密度为Ｏ．５×１０５个／ｍＩ，可以使融合率达剑１８％。

２．３体细胞胚发生途径

体细胞胚发生是指在离体条件下，植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过程。当条什适宜时体细胞经过多次分裂先形成原胚，继而在经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚等不同发育阶段，最后发育成为具有明显胚轴和子叶的成熟体细胞胚。目前胚状体既可以在愈伤组织阶段形成也可以直接在外植体上形成，原生质体培养在形成愈伤组织后也能形成胚状体。由丁．成熟的体胚具有根苹两个极性结构，冈此可一次性再生完整植株。一般认为，体细胞胚只起源于一个细胞，由体细胞胚Ｋ成的植株各部分的遗传组成应当是一致的，不存在嵌合现象。通过胚状体再生植株是植物细胞全能性的一种表现方式，具有繁殖速度快，繁殖系数高，不受地区、季：１了和气候性灾害等自然条件的限制，染色体稳定以及单细胞起源等特点，为基冈一Ｉ：程、细胞．Ｉ：程等生物技术改良果树的遗传特性提供了良好的实验体系（谢从华，２００４）。

目前有关枣胚状体发生途径再生植株的研究比较少。程佑发等（２００１）以临泽小枣子叶．９．

组织培养

河南农业人学２００９届硕．Ｉ：学位论文第一章文献综述切块为外植体，在附加ＩＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上培养，ｌ周后切块边缘可诱导山白色胚性愈伤组织，继续培养１个月后愈伤组织中产生体细胞胚，经细胞学观察发现其发育途径与合子胚相似，也经历球形胚、心形胚和子叶胚等阶段。胚状体转移至无激素的ＭＳ培养基上以后，可发育成完整小植株。李登科等（２００４）对六月鲜枣花斤５８—６０ｄ的幼胚及子叶进行培养获得了人量胚状体，且胚状体最终可发育成凿。

３枣树组织培养技术的应用

３．１多倍体育种

果树多倍体一般具有生长旺盛、果实人且少核或无核、产量高、适廊性和抗逆性强等特点，且能够利Ｈｊ无性繁殖的方式Ｉ嗣定其优良性状，使之保持稳定而不分离，生产上可长期利用（潘一山，２００５）。人一【：诱导多倍体的方法很多，有物理方法、化学方法和生物方法，其中化学方法是目前Ｊ’．泛应用的最有效的方法。

枣属植物中存在人鼙的自然多倍体，如毛叶枣就存在四、入、八倍体类型。赞皇人枣是目前发现的惟一的臼然二倍体品种，人：Ｉ：诱导枣多倍体研究起步较晚。严ｆ：玲等（１９９６）Ｊｔ］不同浓度的秋水仙素溶液处理金丝小枣试管苗单芽苇段，促使其不定芽细胞和染色体组发生变异，通过形态学认定和根尖染色体计数，从中筛选出一批稳定的同源四倍体株系。蒋洪恩（２００４）州秋水仙素在田间对冬枣、辣椒枣等品种进行了诱变，并首次获得了四倍体和八倍体材料。．千．娜等（２００５）以冬枣和酸枣组培曲丛芽和苇段为试材，以秋水仙素为诱变剂，将诱变处理的组培笛丛芽和举段进行４ｄ的预培养、１５ｄ的暗培养，以及在培养基中添加１．５９／Ｌ的活性炭或１．０％－－甲基弧矾，均可有效提高诱变频率，翠段诱变率最高达２６．６７％，丛芽诱变率最高达３６．６７％。但由丁．变异株表现较复杂，常出现暾合现象，为稳定诱变效果，千娜等（２００５）在多倍体枣凿繁殖过程中，必须不断进行鉴定、选择，使多倍体细胞比例加人以达到纯化的目的，这一过拌严重制约着多倍体的育种进程。冈此，研究如何简化甚至省去暾合体分离步骤，将会人人加快多倍体育种速度。

３．２人工种子

人Ｊ：种子是相对丁．天然种子而言的，是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等），包蜱在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的、在适宜条件，卜．能够发芽山苗的颗粒体（张铭，２０００）。完整的人ｊ１：种子包括体细胞胚、人Ｉ：胚乳、人ｊｌ：种皮３部分。与天然种子相比，人Ｉ：种子具有可一ｒ：厂化人规模制备、贮藏和迅速推Ｊｔ．等优点。胡芳名等（２００４）以枣树愈伤组织产生的不定芽为材料，进行了人］：种子制作试验，川海藻酸钠作包坤基质，使用ＣａＣｌ２作络合剂，对包埋材料进行删化，使之成为种皮胶囊。人．Ｉ：种子播种４ｄ左右开始萌动，约７—８ｄ后芽突破种皮，在包埋材料中

ＺＴ＋０．５ｍ∥ＬＩＢＡ，萌发率可达８８．４％；在包埋材料中加人适量杀菌剂，在５。Ｃ

条什。卜．贮藏８周后，萌发率仍可达３５．７％。

．ＩＯ．添加Ｏ．１ｍ∥Ｌ３．３遗传转化研究