Western-blot_试验技术

Western-blot 试验技术

概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。

溶解蛋白策略 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这 可能导致免疫反应性的丢失。 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造 成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞 表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力， 变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调 整提取的条件。 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清 或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多 种形式起反应。

溶解方法 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲 液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后 制备提取液。 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS 凝胶加样缓冲液。 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗 原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液 裂解。

细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得 很粘稠。吸入1.5ml离心管。 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 4度，13000rpm,30分钟离心。分成三层：上层 为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS-PAGE,如不能立即做，可将上 清转入另一Eppendorf -80°C保存

注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡 沫。 检测蛋白的敏感性1-5ng,0.75mm厚的SDS -PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。

主要试剂 RIPA(华舜公司) 苯甲基磺酰氟PMSF(华舜公司) 丙烯酰胺(Amresco公司) 双丙烯酰胺(Amresco公司) 丽春红染料(华舜公司) Tween 20(Amresco公司) 过硫酸铵(Sigma公司) 四

甲基乙二胺TEMED(Sigma公司) 硝酸纤维素膜(Amersham公司) 考马斯亮兰(Fluka公司) 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体(Santa Cruz公司) Phototope-HRP Western Blot Detection System(Cell Signaling Technology公司)

仪器与设备 低温超速离心机(Eppendorf公司) 分光光度计(Eppendorf公司) Thermomixer(Eppendorf公司) 电泳仪(Bio-Rad 公司) 垂直式电泳槽(Bio-Rad 公司) 硝酸纤维素膜电转系统(Bio-Rad 公司)

配制试剂 10×电泳Buffer 称取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去离子水，定容至1000ml SDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 称取18.15克Tris,加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8,定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 称取6.0克Tris,加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8,定容100ml 转膜缓冲液 称取3.03克Tris.base,14.4克Glycine,用ddH2O溶解，定容至 800ml,临用前加200ml甲醇 10*:30.3克Tris.base,144克Glycine,用ddH2O溶解，定容至 800ml。

配制试剂 30%Acry-Bis 29克丙烯酰胺+1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml 配成，避光4℃保存 10%过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存 封闭试剂 10×TBS (应用液：1×TBS) 10×TBS:取24.2克Tris-Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6,定容至 1000ml 1×TBS:取10×TBS 50ml,稀释至500ml,临用 前加0.1%Tween 20,500ul。

配制试剂 4×SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL,溶解在30ml水中，调pH6.8 8克SDS 0.4克溴酚兰 定容至100ml 40ml甘油 10ml DTT贮存液 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。 考马斯亮兰染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质 10ml 冰乙酸 0.25克 考马斯亮兰R250

抗体选择 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象(例 如变性构象或天然构象)。并非所有的单克隆抗体都适合 作为探针用于WETERN-BLOT,因为这一实验中靶蛋白是彻 底变性的。 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物， 通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可 能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白 上的不同抗原表位的效果。 设臵对照： 1不与靶蛋白反应的抗体(即免疫前血清或非相关单克隆 抗体) 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的 制品 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合 物为佳。

实验步骤 配胶 制胶 先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少 许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用 水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积 层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶 干后备用，拔去梳子。 上样，所有

上样孔均加样，没有样本，用上样 缓冲液代替。 100V,溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳 结束。

实验步骤 转膜 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中 平衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝 胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V电 压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以作 标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带，再 用TBST漂洗至膜发白。 封闭 称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml, 使脱脂奶粉浓度为5%。将硝酸膜浸在20ml封闭 液中，室温摇2h后。

实验步骤 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000;将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为 1:2000,并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物 素抗体(浓度为1:1000),将膜臵于二抗稀释 液中，室温振荡孵育1h;而后吸弃二抗稀释液， 用1×TBST洗3次，每次5min。

实验步骤 显影：将膜臵入10ml LumiGLO溶液中 (10ml LumiGLO溶液配方为：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、 9.0ml Milli-Q water),室温轻摇1分钟， 注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大 小的胶片，压在暗盒中，约1min;将胶片 放在显影液中洗1-5min;水冲洗；定影液 中洗2-5min;水冲洗，可在相应位臵见到 目的条带。