PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

第27卷第7期

2007年7月

环　境　科　学　学　报　ActaScientiaeCircumstantiae

Vol.27,No.7Jul.,2007

刘有胜,杨朝晖,曾光明,等.2007.PCR2DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析[J].环境科学学报,27(7):1151-1156

LiuYS,YangZH,ZengGM,etal.2007.ApplicationofPCR2DGGEtoanalyzingbacterialcommunitiesinculinarywastecompost[J].ActaScientiaeCircumstantiae,27(7):1151-1156

PCR2DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结

构分析

刘有胜,杨朝晖,曾光明,肖勇,杨恋,徐峥勇

湖南大学环境科学与工程学院,长沙410082

收稿日期:2006207218　　　修回日期:2007201215　　　录用日期:2007203219

摘要:使用基于16SrDNA的PCR2DGGE(变性梯度凝胶电泳).在堆肥不同时间取样,进行了堆肥温度、pH、含水率、,堆肥温度高于50℃的天数为7d,最高达65℃,可有效杀灭致病菌;最终pH,不同时间堆肥样中细菌DGGE图谱有着明显的差异性;堆肥升温期细菌种群丰富,;,优势种群明显;降温期细菌种群结构基本保持稳定.温度对堆肥过程中细菌种群具有明显的筛选作用.Cs值比较低,堆肥处理后细菌种群结构与堆肥原料之间存在明显差异.关键词:餐厨垃圾;堆肥;DGGE;细菌种群结构

文章编号:025322468(2007)0721151206　　　中图分类号:X172　　　文献标识码:A

3

ApplicationofPCR2DGGEtoanalyzingbacterialcommunitiesinculinarywaste

compost

LIUYousheng,YANGZhaohui,ZENGGuangming,XIAOYong,YANGLian,XUZhengyong

CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,HunanUniversity,Changsha410082

Received18July2006;　　　receivedinrevisedform15January2007;　　　accepted19March2007

Abstract:Polymerasechainreaction2denaturinggradientgelelectrophoresis(PCR2DGGE)http://postsweresampledduringdifferentcompostingperiods,andthechangesoftemperature,pH,watercontent,organicsubstancecontentandtheratioofcarbontonitrogenweremeasured.Theresultsshowedthatthepilewasinsulatedandtemperaturesabove50℃weremaintainedfor7days.Thehighesttemperatureinthecompostwas65℃,whichwashighenoughtokillpathogens.ThefinalpHwas715andtheC/Nwas20.04,andthusthefinalproductcouldbeusedasorganicfertilizer.AfterextractionandpurificationofgenomicDNAfromthesamplecompost,the16SrRNAgenes(V3region)wereamplifiedbyusingthebacterialprimerpairGC2341F/907R.Then,theamplified16SrDNAfragmentswereseparatedbyDGGE.DifferentDGGEbandsappearedduringdifferentcompostingperiods.TheCsvaluesofpairwisesimilaritycoefficientwereanalyzedforsamplesfromcompostingdays0,4,10,14,and18.TheCsvalueofmicro2ecologicalstructurewasthehighestonthe4thday,Temperatureappearstoplayakeyroleindeterminingthecompositionofbacteriapresentattherespectivestagesofthecompostingprocess.Keywords:culinarywaste;compost;DGGE;bacterialcommunity

3

1　引言(Introduction)

餐厨垃圾是指剩菜、剩饭、菜叶、果皮等容易被

微生物分解的有机物,属于易腐性有机垃圾,表现

为有机物含量高、含水率高、热值低、易造成疾病感染,不宜进行填埋和焚烧处理.根据减量化、无害化

基金项目:国家重点基础研究(973)发展计划项目(No.2005CB724203);国家自然科学基金资助项目(No.50478053);湖南省自然科学基金资助项目(No.04JJ3004,05JJ2004);湖南省科技计划项目(No.05FJ3001);长沙市科技计划重点项目(No.K051132272)

SupportedbytheNationalBasicandDevelopmentResearchProgram(973Program)(No.2005CB724203),NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.50478053),NationalNaturalScienceFoundationofHunan(No.04JJ3004,05JJ2004),ResearchProjectofScienceandTechnology,Hunan(No.05FJ3001)andKeyResearchProjectofScienceandTechnology,Changsha(No.K051132272)

作者简介:刘有胜(1981—),男,硕士研究生,E2mail:lys2000@http://;3通讯作者(责任作者)

Biography:LIUYousheng(1981—),male,E2mail:lys2000@http://;3Correspondingauthor

PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

1152环　　境　　科　　学　　学　　报27卷

和资源化的“三化”原则,可用堆肥化处理城市餐厨

垃圾.堆肥是利用自然界中广泛存在的微生物,在人工控制的条件下,将可生物降解的有机物转化为肥料的过程(李国学,2000).研究表明,可培养微生物仅占自然界微生物的0.1%～10%(Muyzer,1993),不能很好地反映自然环境中微生物多样性的原始状态(Amann,1995).随着分子生物学和系统发育分析方法的发展,基于16SrDNA基因的分子生物学方法逐渐被用来分析复杂的生态系统.目前,16SrDNA的PCR扩增片断通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法已用来分析微生物群落结构的变化(Ishii,2000;Cahyanietal.,2003;etal.,2005).,并采用聚合酶梯电泳(PolymeraseChainonGradientGelElectrophoresis,PCR2DGGE)技术研究堆肥过程中细菌种群结构的动态变化,通过比较堆肥不同时期细菌的16SrDNA基因信息来了解细菌种群结构的变化,以期为城市餐厨垃圾堆肥机理研究及优化堆肥

处理过程提供更多的信息.

2　材料与方法(Materialsandmethods)2.1　堆肥材料与处理

将采集来的城市餐厨垃圾初步烘干后与填充料(新鲜土壤)以质量比(4∶1)的比例混匀以调节餐厨垃圾含水率和C/N(张相锋等,2003),并以此作为堆肥原料.堆肥原料的理化性质见表1.将混合物堆置于约30L的器皿内,,用来装.将堆肥器皿移至培30℃,.每4d进行1次,保持好氧条件.堆肥原始料设为0号,从堆肥开始每天取样,堆肥时间从2006年3月14日至4月1日,堆肥过程持续18d,每天上午10:00进行取样,编号分别为1～18,并实时测量温度、pH值、含水率等参数.所采取的样品于-20℃冰箱保存待分析.

表1　堆肥材料的主要理化性质

Table1　Maincharacteristicsofcompostingmaterials

物料餐厨垃圾土壤堆肥原料

含水率

75.2%15.7%54.6%

温度/℃

172218

pH值4.26.86.5

有机质含量

57.36%3.24%36.64%

-1

TN0.65%0.14%0.55%

C/N51.2113.4531.01

2.2　PCR2DGGE分析方法

2.2.1　基因组总DNA的提取与纯化　DNA的提

取与纯化采用改进的蛋白酶K2CTAB法(杨朝晖等,2006):称取0.5g堆肥样品与3mL(120mmol L

-1

13000r min下离心20min;弃上清,加入1mL冰预

)

磷酸盐缓冲液混合,振荡3min后在9000r min下离心5min.洗涤过的样品中加1mLDNA提取液

-1

(100mmol L-1Tris2HCl,pH8.0,100mmol L

-1

EDTA,pH8.0,100mmol L磷酸盐缓冲液,pH

-1

810,115mol LNaCl,1%CTAB)和蛋白酶K

-1-1

(20μL,10mg mL),于37℃、225r min下摇床摇

μL(20%)SDS,65℃下水浴动30min;再加入150

2h,每隔15～20min轻轻摇动一下,在室温、9000

-1

r min下离心10min,沉淀中再加入0.5mLDNA提取液,重复上述操作后合并上清液,加入等体积氯

-1

仿/异戊醇(体积比24∶1),在9000r min下离心

μL进行10min,吸取水相转移到5mL离心管中.取5

1%琼脂糖凝胶电泳检测.纯化步骤:在粗提DNA中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀1h以上,在4℃、

-1

冷的70%乙醇洗涤沉淀,4℃、13000r min下离心

μL无菌、5min;再弃上清,沉淀自然风干,加入120

μL进行1%琼脂糖凝胶电去离子水重悬沉淀.取5

泳检测.

2.2.2变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析　纯化后的总DNA进行PCR扩增.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸1min,

μL,其35个循环;72℃延伸10min.PCR反应体系50

μL,10中包括10×PCR反应缓冲液(withMgCl2)5μL,10的dNTP溶液(TianGen,北京)2

-1

μmol L的细菌通用引物GC2341F和907R各μL(Muyzeretal.,1998a),序列分别为:GC2015

341F,(5CCTACGGGAGGCAGC

);907R,5’AG23’2CCGTCAATTCCTTTGAGTTT).扩增片断长约600bp.(下划线部分为“GC”夹).TaqDNA聚合酶(TianGen,北京)为2.5个单mmol L

-1

-1

PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

7期刘有胜等:PCR2DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析1153

μL.PCR扩增产物用1%琼脂糖凝位,DNA模板为1

胶电泳检测.

TM

采用Bio2Rad公司Dcode的基因突变检测系统对PCR反应产物进行电泳分离.电泳条件:凝胶变性梯度30%～65%,电泳缓冲液为1×TAE,电压140V,电泳温度60℃,电泳时间16h.电泳结束后用EB染色30min,在清水中退染20min,然后用Bio2RadGelDoc2000凝胶成像系统观察结果并拍照.2.2.3DGGE图谱相似性(Cs)分析:　通过比较相似性系数(Cs)来分析堆肥工艺不同阶段指纹图谱的相似性(Gillanetal.,1998;Murray,1996;傅以钢等,2005),Cs值变化范围为(0～100):

Cs=2j/()

机物质逐渐被微生物降解,有机质含量减少;到堆

肥稳定期时,堆肥物料有机质含量为21.6%左右.C/N是底物堆肥性能的指示参数,其最适值为25～30,本研究中堆肥原料的C/N比为31.01;在整个实验过程中,C/N比基本呈下降趋势,最后达到20.04

.

式中,a、b晰的DGGE,ab中共有的条带数目.3　结果(Results)

3.1　堆肥过程中温度、pH、含水率、有机质、C/N的

图2　含水率、有机质、C/N的变化

Fig.2　Changesofwatercontent,organicsandC/N

变化

图1是堆肥过程中温度与pH的变化曲线图.堆肥温度在50℃以上的时间为7d.堆肥初始pH值有一个微降的过程,从第3d开始,堆体的pH值就随着温度的升高而处于一个稳定上升的趋势,这可能与微生物活动过程中有机氮的氨化作用和矿化作用有关.整个堆肥处理过程中pH基本维持在6.0～8.0之间,最终pH值接近7.5

.

3.2　堆肥样基因组总DNA的提取与PCR扩增

粗提总DNA凝胶电泳图见图3a.电泳结果显示:采用文中的提取方法可以顺利提取出堆肥样品中的总DNA片段,长度在23kb左右.这个结果说明,使用的DNA提取方案没有导致严重的DNA断裂.对粗提总DNA进行纯化,纯化后的DNA凝胶电

图1　堆肥温度与pH值的变化

Fig.1　Changesoftemperature,pH

图2为堆肥过程中含水率、有机质、C/N的变化

曲线图.堆肥原料的含水率为54.6%,处于一般堆肥含水率最适宜范围(40%～60%).含水率在堆肥开始阶段逐渐上升,运行一段时间后,堆体中含水率就基本保持持续降低的态势.堆肥原料的有机质含量为36.64%,随着堆肥过程的进行,堆体中的有

图3　堆肥样DNA粗提与纯化

Fig.3　CrudeextractedandpurifiedDNAofcompostingsamples

(M:λDNA/HindⅢ)

PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

1154环　　境　　科　　学　　学　　报27卷

泳图见图3b.经过纯化后去除了粗提总DNA中的

腐质酸与其它杂质,同时提高了总DNA的纯度与浓度,有利于PCR扩增.PCR扩增凝胶电泳图如图4所示.电泳图显示,PCR产物片段长度为600bp左右;扩增出了目的DNA条带,各个样品的扩增产物均可以作为变性梯度凝胶电泳(DGGE)的样品

.

图4　rDPCR产物

Fig.4　16SrDNAPCRproductofcompostingsamples(M:Marker

Ⅴ)

3.3　DGGE指纹图谱结果与Cs值分析

城市餐厨垃圾堆肥样品的PCR扩增产物通过

DGGE分离,其DGGE图谱如图5所示.由图可知,堆肥样品的PCR产物经DGGE分离出数目、强度和迁移位置都不同的条带,这些不同位置的条带代表着不同的细菌种群(Konstantinovetal.,2003);电泳条带越多,说明细菌种群越多(Muyzer,1998b),条带信号越强,表示该条带代表的相应细菌数量越多.由图5可以看出:堆肥原料(泳道0d)中细菌种群较多,优势种群不明显.随着堆肥过程的进行,电泳条带逐渐增加,优势种群逐渐形成,在堆肥的前4d(泳道0～4d),条带d、j、l、m的强度逐渐减弱,条带b、c、g、n、o的强度逐渐增强,细菌经过了温度的筛选.从第6d开始,堆体进入堆肥高温期,电泳条带明显减少,出现了明显的优势种群条带,分别为:第6d的条带i,第8d的条带e,第10d的条带h,第12d的条带p.堆肥14d后,堆体进入降温阶段,电泳条带较高温期有所增多,条带基本保持稳定;条带h、p、r所代表的细菌经历高温期后,一直到降温期仍然存在于堆体中,条带k、q则几乎存在于整个堆肥周期,说明这些条带所代表的细菌具有较广的温度适应范围.

由表2DGGE图谱相似性(Cs)值分析整体上Cs不高,说明堆肥过程中细菌经历了比较明显的时序动态和更替.堆肥原料经过4d的升温后种群结构的Cs值为75(泳道0,4),第4d与随后堆肥阶段的种群结构Cs相对来说比较高,分别为73(泳道

4,

图5　城市餐厨垃圾堆肥样DGGE图谱和DGGE条带强度示

意图

Fig.5　DGGEpatternsandDGGEbandintensityofurbanfood

wastecompost

10)、70(泳道4,14)、68(泳道4,18).通过温度筛选

的耐高温的细菌成为高温期的优势种群.第10d种群结构的Cs值显著下降为41(泳道0,10),大量细菌在高温阶段被淘汰.到第14,18d温度下降后种群结构的Cs值仅为48(泳道0,14)、45(泳道0,18),这说明经过堆肥处理后微生态结构的功能与组成都与堆肥原料之间存在很大的不同.

表2　DGGE图谱相似性Cs值分析

Table2　PairwisesimilaritycoefficientoftheDGGEprofile

Cs值

0d10075414845

4d75100737068

10d41731006661

14d48706610073

18d45686173100

堆肥天数

/d04101418

PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

7期刘有胜等:PCR2DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析1155

4　讨论(Discussion)

4.1　堆肥温度变化对细菌种群的影响

对于堆肥系统而言,温度是堆体中微生物生命活动的重要标志.从图6中可以看出,温度与DGGE

条带数的对应关系:升温阶段(0～4d)DGGE条带数随着温度的升高由13条增加到17条,高温阶段(8～12d)DGGE条带数明显减少,在最高温度(第10d)时DGGE条带数仅为8条,而在降温阶段(14～18d)DGGE条带数变化不大,基本保持在10条左右.这表明,随着温度的变化细菌种群呈现动态变化.堆肥升温期,堆层基本呈中温,跃,量,;℃以上后,甚至死亡,如条带a、b、c、d、n所代表的细菌,而嗜热细菌则大量繁殖,表现为优势种群.高温期持续一段时间后,由于有机物的消耗,堆肥产生的热量不足以维持高温,于是温度开始下降,基本维持在中温(20～40℃),部分嗜热细菌死亡,如条带e、i所代表的细菌,部分嗜温细菌又开始生长,如条带n、q所代表的细菌.可以说堆肥过程是微生物群落结构与堆肥温度相互制约的过程,温度无疑是堆肥过程中的最佳控制参数

.

加入异丙醇和乙醇等可降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集而析出.由于该方法对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作要求在低温下进行.因此,在本实验中,加入异丙醇和乙醇反应条件为4℃.经纯化后的基因组总DNA中PCR反应抑制剂的含量大大降低,为后续的PCR反应提供了高纯度的DNA模板.本实验中,纯化总DNA的凝胶电泳图3b中有比较明显的拖带现象,DNA断裂DNA凝胶电DGGE技术作为一种可研究微生物群落复杂性和行为的分子生物学工具,因其可同时对多个样品进行分析,使之非常适合调查微生物群落的时空变化.DGGE条带亮度可体现堆肥不同阶段优势种群变化,但当堆肥微生物多样性很高时,可能导致PCR产物中每一种微生物的PCR产物太少,而不能形成明显的条带(Shabir,2005).图5中,堆肥前几天图谱条带不是很明显可能就是这个原因.同时DGGE图谱也受变性梯度范围、引物的选择、电泳时间、染色等等因素的影响.通过优化各个反应条件可以得出更加真实反应堆肥微生物多样性的DGGE图谱,这有助于全面和深刻地理解堆肥过程微生物变化规律,优化控制堆肥过程提供理论基础,有利于进一步提高堆肥进程,缩短堆肥时间.5　结论(Conclusions)

1)城市餐厨垃圾进行的好氧堆肥,堆肥原料含

图6　不同温度下DGGE条带数

Fig.6　NumberofbandsintheDGGEpatternsatdifferent

temperatures　

4.2　基因组总DNA的提取与DGGE分析

水率为54.6%;堆肥温度在50℃以上的时间为7d,最高达65℃,可有效杀灭致病菌;pH值维持在6.0～8.0之间,最终pH值约7.5,C/N为20.4.

2)DGGE图谱显示,堆肥升温期细菌种群丰富,优势种群不明显;高温期细菌种群减少,优势种群明显;降温期细菌种群结构基本保持稳定.温度对细菌种群有明显的筛选作用.

3)在城市餐厨垃圾堆肥过程中,堆肥各阶段DGGE图谱相似性Cs值均比较低,堆体细菌群落经

为了减少细胞外DNA和可溶性有机物的污染,实验中加入磷酸盐缓冲液进行预处理,并使用DNA提取液CTAB和SDS.Zhou(1996)在对土壤DNA提取方法的比较中发现,在提取缓冲液中加入CTAB和SDS可以更好的降低腐殖质的污染,同时不会导致DNA的损失.纯化采用异丙醇沉淀法,其原理是

历了明显的演变过程,群落结构和优势种群具有时

序动态性.堆肥处理后细菌种群结构与堆肥原料之间存在明显差异.

通讯作者简介:杨朝晖(1963—),男,博士,教授,主要研究方向为环境生物技术.E2mail:yzh@http://.

PCR_DGGE技术对城市餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构分析

1156环　　境　　科　　学　　学　　报27卷

MuyzerG,deWaalEC,UitterlindenAG.1993.Profilingofcomplex

References:

AmannRI,LudwingW,SchleiferKH.1995.Phylogeneticidentification

andinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation[J].MicrobialRev,59(1):143—169

CahyaniVR,MatsuyaK,AsakawaS,etal.2003.Successionand

phylogeneticcompositionofbacterialcommunitiesresponsibleforthecompostingprocessofricestrawestimatedbyPCR2DGGEanalysis[J].SoilSciPlantNutr,49:619—630

FuYG,WangF,HePS,etal.2005.Analysisofmicrobialcommunity

structurewithDGGEsludgecomposttechnology[J].EnvironmentalScience,25(Suppl):98—101(inChinese)

GillanDC,SpeksnijderAGCL,ZwartG,etal.1998.Geneticdiversityof

thebiofilmcoveringMontacutaferrugi2nosa(BevaluatedbydenaturingcloningofPCRgener[J].ApplEnvironMicr9):—IshiiK,FukuiM,TakiiS.Microbialsuccessionduringacomposting

processasevaluatedbydenaturinggradientgelelectrophoresisanalysis[J].JournalofAppliedMicrobiology,89:768—777KjellerupBV,VeehRH,SumithraratneP,etal.2005.Monitoringof

microbialsouringinchemicallytreated,produced2waterbiofilmsystemsusingmoleculartechniques[J].Biotechnol,32:163—170

KonstantinovSR,ZhuWY,WilliamsBA,etal.2003.

Effectof

fermentablecarbohydratesonpigletfacialbacterialcommunitiesasrevealedby16SribosomalDNA[J].FEMSMicrobiologyEcology,43:225—235

LiGX,http://postingofsolidwasteandproductof

organic2chemicalmixedandfermentedferti2lizer[M].Beijing:ChemicalIndustryPress,19—30(inChinese)

MurrayAE,HollibaughJT,OrregoC.1996.Phylogeneticcompositionof

bacterioplanktonfrom

twoCalifornia

Esturiescompared

by

denaturinggradientgelelectrophoresisof16SrDNAfragments[J].ApplEnviroMicrobiol,62(7):2676—2680

J

IndMicrobiol

China

microbialpopulationsbydenaturinggradientgelelectrophoresisanalysisofpolymerasechainreaction2amplifiedgenescodingfor16SrRNA[J].ApplEnvironMicrobiol,59:695—700

MuyzerG,BrinkhoffT,NubelU,etal.1998.Denaturinggradientgel

electrophoresis(DGGE)

inmicrobialecology[J].Molecular

MicrobialEcologyManual,34(4):1—27

MuyzerG,SmallaK.1998b.Applicationofdenaturinggradientgel

electrophoresis

(DGGE)

and

temperature

gradient

gel

electrophoresis(TGGE)inmicrobialecology[J].AntonievanLeeuwenhoek,73:127—141

AKuenenJ.NestedPCR2Denaturing

rtoDeterminetheDiversityof2inComplexMicrobialCommunities[J].liedandEnvironmentalMicrobiology,71(5):2325—2330YangZH,XiaoY,ZengGM,etal.2006.DNAExtractionMethodsfrom

CompostforMolecularEcologyAnalysis[J].Science,27(8):1613—1618(inChinese)

ZhouJZ,BrunsMA,TiedjeJM.1996.DNArecoveryfromsoilsof

diversecomposition[J].ApplandEnvirlMicrob2iology,62:316—322

ZhangXF,WangHT,NieYF,etal.2003.Co2compostingofHigh

MoistureVegetableWaste,FlowerWasteandChickenLitterinPilotScale[J].EnvironmentalScience,24(2):147—150(inChinese)

Environmental

中文参考文献:

傅以钢,王峰,何培松,等.2005.DGGE污泥堆肥工艺微生物种群结

构分析[J].中国环境科学,25(增刊):98—101

李国学,张福锁.2000.固体废物堆肥化与有机复合肥生产[M].北

京:化学工业出版社,19—30

杨朝晖,肖勇,曾光明,等.2006.用于分子生态学研究的堆肥DNA提

取方法[J].环境科学,27(8):1613—1618

张相锋,王洪涛,聂永丰,等.2003.高水分蔬菜废物和花卉、鸡舍废物

联合堆肥的中试研究[J].环境科学,24(2):147—150