应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的纤维化相关(2)

目的 探讨纤维化相关基因, 特别是与转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。 方法 收集临床重度肾积水新鲜标本12例,正常肾组织标本6例,分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白(Bone

关基因，芯片号APHS-035A。TRIZOL试剂购于Invitrogen life technologies公司。RNeasy® MinElute 纯化试剂盒购于Qiagen公司，甲醛上样染液购于ambion公司，其他试剂均购于华美生物工程公司。反应平台为ABI Prism7700高通量荧光PCR系统（Applied Biosystems）。

2. 研究方法

2.1 总RNA的提取与纯化

取(50~100)mg组织样品，采用Trizol一步法提取其中的总RNA[5]，纯化过程参照RNeasy® MinElute 试剂盒说明书进行，所得总RNA和mRNA经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行质量分析。

2.2 实时定量PCR

将总RNA混合液25µl加到芯片上对应的每个孔中，小心密封芯片并置于冰上。实时定量PCR程序设置完后，将加好样的芯片置于ABI Prism7700高通量荧光实时定量PCR系统进行反应，记录检测到之反应体系中荧光信号的强度值（Ct）。

2.3 结果分析

采用比较阈值法（ Ct法）[6]，两组中每个基因的表达记为 Ct。公式： Ct =平均Ct –管家基因平均Ct。每个基因表达的组间差异记为 Ct。公式： Ct = Ct (组H) - Ct (组N)。其中组N是正常对照组，组H是重度积水组，通过计算2- Ct比较两组基因的表达差异。当某2- Ct值≤0.5（下调）或≥2（上调）时，认为该基因在两组间表达的差异有显著性意义。

3. 结果

根据本组芯片筛查的结果，在12例积水肾组织中表达一致性较好的基因有89个。按照我们的标准，与正常肾组织比较表达具有显著性差异的基因有49个。其中显著性上调25个，主要有BMP3、Col-Ⅰα1、Nodal、GSC、IGF1等；显著性下调24个，主要有Lefty 1、BMP 7、BMP 2和BMPER等。部分数据详见表1和表2（其中2- Ct值越高提示该基因在积水肾组织中上调程度越大，反之则提示下调程度越明显）。

4. 讨论

随着人类基因组DNA测序的完成，功能基因组学（Functuional genomics）成为了基因研究的主流。它利用结构基因组（structural genome）所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或在系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因/蛋白的研究转向对多个基因/蛋白同时进行系统的研究[7]。众所周知，严重的肾积水是导致肾纤维化的常见原因，而肾积水-纤维化的改变是一个多基因、多细胞因子、多信号通道共同参与的复杂病理过程。要了解其中发生的信号转导机制，有机地运用功能基因组学技术是解决问题的重要途径之一。

基因芯片的发展为达到这一目的提供了有力的技术支持，该法能在同一条件下一次性筛检众多基因的差异表达，具有高通量、高并行性、高效率、上样量相对少等优点，目前在肿瘤、遗传性和感染性疾病的研究中已有较为广泛的应用[5, 8-9]。PCR基因芯片除了具备前述