快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法(2)

2010年第2期Vol.20No.2检验检疫学刊JOURNALOFINSPECTIONANDQUARANTINE

免疫层析试纸条,对阳性血清进行敏感性检测,并对健康人血清进行筛查,将检测结果与美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒比较,对试纸条特异性进行评价。2　材料与方法2.1　材料纯化的WNVNS1抗原、WNVNS1蛋白及其免疫兔血清均为本课题组制备,健康人血清来自丰台区疾病预防控制中心,氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸三钠(NaC6H5O7)购自Sigma公司,牛血清白蛋白(BSA)购自Roch公司,硝酸纤维素膜、玻璃纤维、滤纸等均购自Minipore公司,脱脂奶粉为伊利高蛋白脱脂高钙奶粉,WNVIgGELISA试剂盒购自Focus公司。2.2　方法2.2.1　抗原、将纯化的用5mmol/LPH8.0的PB4℃搅拌透析过夜。测浓度为1.8mg/ml。

将纯化的兔抗WNVNS1蛋白多克隆抗体溶液1mL用5mmol/LPH8.0的PB溶液500mL4℃搅拌透析过夜。测浓度为2.76mg/mL。2.2.2　器皿的清洁

先用洗洁精将玻璃器皿及转子的污物洗净,用自来水、蒸馏水冲洗、干燥,随后,将其放入酸缸中浸泡24小时,分别用自来水、蒸馏水、双蒸水冲洗3

～4遍,干燥后备用。2.2.3　胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法,制备25nm的胶体金。

具体操作方法如下:取100mL双蒸水,加热至沸腾,加入1mL1%的氯金酸,搅拌下准确加入1.5mL体积分数为1%的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色,续而转成黑色,随后逐渐稳定成酒红色,20min后停止加热。冷却至室温后4℃避光保存。2.2.4　胶体金溶液的最佳值确定取,分别用0.2mol/L065、7.0、7.5、8.0、8.

g/mLWNVNS1蛋白溶液..2

,静置10min后,加入100μL质量分数为10%为NaCl溶液,静置0.5h后观察胶体金颜色。胶体金颜色没有发生改变的最低pH值为胶体金溶液的最佳pH值。2.2.5　分光光度计测定法确定最低蛋白稳定量

在标记前,应首先测定能稳定一定量胶体金所需要的最小蛋白用量。将胶体金溶液调至最佳PH值,抗原经高速离心除去大的聚集物,用5mmol/LPH8.0的PB溶液稀释至0.2mg/ml,稀释后抗原与其它有关试剂按表1逐项操作,用分光光度计OD580测定。

表1　测定稳定胶体金最小蛋白计量

试剂

抗原(μL)缓冲液(μL)胶体金(mL)

试验管

110001

290101

380201

470301

560401

650501

740601

830701

920801

1010901

对照管

100(H2O)

01

摇匀,放置2min

10%NaCl(μL)

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

2.2.6　胶体金标记WNVNS1蛋白

璃纤维,吸收垫用吸水滤纸。以浓度为1.38mg/mL的兔抗WNVNS1蛋白多克隆抗体在硝酸纤维素膜

上划线作为质控带;以浓度为0.9mg/mL的WNVNS1蛋白在硝酸纤维素膜上划线作为检测带,参数μL/mm划线,指控带与检测带间距约为7mm。0.1

划线后,将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中孵育2h。将吸收垫、样品垫及结合垫、硝酸纤维素膜叠

将胶体金调至最适PH值,加入最低蛋白稳定

量的WNVNS1蛋白。静置5min后加入过量BSA封闭,离心,用0.01mol/LTris溶液重悬,低速离心去除聚集物,上清液即为胶体金标记的抗原。2.2.7　免疫层析试纸条的制备免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品垫和结合垫用玻

加,组装成完整的层析条,然后切割层析条,宽度

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