流动注射协同增强化学发光免疫分析法的建立与评价

流动注射协同增强化学发光免疫分析法的建立与评价

分析化学(FENXIHUAXUE)　研究报告第7期

2002年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry792～796第30卷

流动注射协同增强化学发光免疫分析法的建立与评价

骆建新　郑崛村　王伦安　李晋川　邱　岳

(第三军医大学成都军医学院医学检验教研室,成都610083)

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伍莉萍　杨秀岑

(四川大学华西药学院,成都610041)

摘　要　以兔IgG为模型,NaTPB与PPP协同增强的Luminol2H2O22HRP混合液为发光体系,HRP标记抗体,建立了灵敏度高、特异性强、重现性好的流动注射协同增强化学发光免疫分析法。结果表明:在2～60μgΠL范围内兔IgG量与发光强度有良好的线性关系,相关系数r=0.9941(P<0.01);绝对检测限为0.65fmol;方法精密度为4.72%～9.31%;回收率为92.50%～99.40%。免疫柱可反复使用200次以上。本法测定不同浓度兔

IgG标准溶液的结果与RIA法的测定结果基本一致。

关键词　流动注射免疫分析,协同增强作用,化学发光免疫分析,兔IgG

1　引　　言

化学发光分析灵敏度高、线性范围宽、设备简单,是一种应用极其广泛的现代医药检测方法。随着流动注射分析技术和免疫分析技术的不断发展,化学发光分析具有更广泛的应用前景。为了提高化学

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发光分析的灵敏度,目前广泛采用增强剂。1996年Ji等在研究增强剂的协同增强作用时,发现增强剂联苯硼酸与82氨基252氯272苯基并哒嗪二酮具有明显的协同增强作用;本实验室还发现在鲁米诺2过氧化氢2辣根过氧化物酶(luminol2H2O22HRP)发光体系中增强剂四苯基硼酸钠(sodiumtetraphenylborate,

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NaTPB)与对苯苯酚(para2phenylpenol,PPP)也有明显的协同增强作用,可显著提高分析灵敏度。本研究将流动注射分析、免疫分析和化学发光分析集为一体,以兔免疫球蛋白G(immunoglobulinG,IgG)为模

型,NaTPB与PPP协同增强的Luminol2H2O22HRP混合液为发光体系,HRP标记抗体,建立了灵敏度高、特异性强、重现性好的流动注射协同增强化学发光免疫分析法(flowinjectionsynergisticenhanced

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chemiluminesentimmunoassay,FISECLIA)。该方法用于胰岛素测定,结果比较满意。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

IFIS2A型智能流动注射分析仪(西安弹簧研究所);GD21型微光测定仪(西北有色地质研究所);UV2120型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

多孔玻璃(controlledporeglass,CPG);羰基二咪唑(1,12carbonyldiimidazol,CDI);鲁米诺(luminol),四苯硼钠(sodiumtetraphenylborate,NaTPB);对苯苯酚(para2phenylphenol,PPP)和辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)(英国Sigma公司);兔IgG,羊抗兔IgG及羊抗兔IgG2HRP(华美公司);协同增强发光混合液为本实验室制备。2.2　实验装置见图1。2.3　发光底物溶液的配方优化

2

利用“均匀设计法”对Luminol2H2O22HRP协同增强发光体系中Luminol、H2O2、NaTPB和PPP的浓度进行优化,确定出该协同增强发光体系的最佳浓度组合。2.4　免疫柱的制备和分析程序的设置

　2001210208收稿;2002203206接受

本文系卫生部科学研究基金(No.941219)、四川省卫生厅科学研究基金(No.000220)资助课题

流动注射协同增强化学发光免疫分析法的建立与评价

第7期

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骆建新等:流动注射协同增强化学发光免疫分析法的建立与评价7　　93

按文献以羰基二咪唑(1,12carbonyldiimidazol,CDI)为偶联剂,将羊抗兔IgG抗体固定在多孔玻璃

(CPG)上,固定有抗体的CPG(约500mg)装入Φ5×40mm的有机玻璃柱中。柱的两端用玻璃棉封口,螺帽的丝口用凡士林密封,置于0.02molΠLpH7.4的PBS缓冲溶液(含0.05%NaN3、1%BSA)中,4℃保存待用。根据图1,参照文献设置分析程序

。

3

图1　流动注射化学发光免疫分析系统

Fig.1　Schematicdiagramofamanifoldusedsystemfortheflowinjectimmunoassaydetermination

S.样品(sample);PA.蠕动泵A(peristalticpumpA);PB.蠕动泵B(peristalticpumpB);R1.样品环1(ring1);R2.

样品环2(ring2);L2A.标记抗体(lablled2Ab);B1.磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffer,pH7.4);B2.硼砂2硼酸缓冲溶液(borax2boricacidbuffer,pH8.5);RB.再生缓冲溶液(regeneratebuffer,pH2.2);LM.发光混合溶液

(lightmixture);V.进样阀(samplinginletvalve);IC.免疫柱(immuno2column);D.微光检测器(detector);W.(waste)。

3　结果与讨论

3.1　协同增强发光体系的浓度优化

对苯苯酚是化学发光分析中常用的发光增强剂,四苯基硼酸钠是张文艳等于1998年发现的新型发光增强剂。本文根据参考文献和预实验提供的发光体系浓度作为确定发光体系各组分浓度的基础,详细探讨了发光体系中Luminol、H2O2、NaTPB和PPP的浓度对化学发光强度的影响。实验发现增强剂NaTPB和PPP具有明显的协同增强作用,可使Luminol2H2O22HRP的发光值(HRP浓度为8×10优化后的协同增强作用更佳,Luminol为6×10PPP为4×10

-4

-4

-10

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gΠmL)比增强剂(NaTPB或PPP)单独作用时分别增强82%和77%(P<0.01)。该发光体系“均匀设计”

molΠL,H2O2为1×10

-3

molΠL,NaTPB为6×10

2

-4

molΠL,

molΠL的发光体系协同增强作用最强,发光强度可再增强26%(P<0.01)。这种优化的

发光体系用于HRP的测定,其灵敏度和重现性比两种增强剂单独使用时都高,该发光体系用于胰岛

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素免疫测定,其结果也比较满意。312　免疫柱的制备3 …… 此处隐藏：6490字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……