拟南芥基因的图位克隆技术
回复率。它们在SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化现象,结果,有可能减少了SUPERMAN基因转录子的表达。它们中没有一个是和SUPERMAN的DNA序列改变联系在一起的;尽管如此,它们能被带有SUPERMAN基因的转基因所补充。目前,对于这种表观遗传突变是怎么产生的以及它们出现的频率知道的不多。
关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。通常这种变化是比较小的,对作图的分辨率也只有较小的影响(Copenhaver等,1998)。但是,有证据表明有些染色体区域是例外的。例如,对GURKE基因的图位克隆就非常困难,这个基因的定位接近于第一条染色体的着丝粒;在着丝粒附近重组是严格限制的,使得对它精细定位的努力非常无效。而且,在这个区域中重复DNA单元的广泛分布使我们辨认出散布的单拷贝序列,这些单拷贝序列能产生有疑问的遗传标记(R. Torres Ruiz,个人交流)。这个发现是经过对第二条染色体上的物理和遗传距离之间的比值的系统地分析之后确认的(Lin等,1999)。对这条染色体的几乎全序列,1%重组的遗传距离相当于100~400 Kb的物理距离,平均是250 Kb。然而着丝粒区域是一个显著的例外,在这里1%重组的遗传距离相当于1000~2500 Kb。看来值得指出的是在现存的物理图谱中,拟南芥的五个着丝粒是没有一个被完全覆盖的。最近对着丝粒区域的分析显示这些区域通常包含重复的DNA和几乎不含表达的基因(Copenhaver等,1999)。因此,由于接近着丝粒,应该没有拟南芥基因是不服从图位克隆策略的。
除了着丝粒,第二条染色体上也有一个小片段上1%重组的遗传距离相当于1000 Kb甚至更多。根据推测,观察到的低重组率现象可能是由于被用于作图分析的株系的DNA序列的重排(Lin等,1999;Mayer等,1999)。第二和第四条染色体的DNA序列的比较显示有些基因片段是在这两条染色体之间被复制的(其中一个片段的大小是4.6 Mb),还有一个从线粒体基因组向第二条染色体转移的DNA片段(Lin等,1999)。这些发现清楚地证明了拟南芥基因组的结构是可以不断改变的。因此,不同株系之间的遗传变异可能不仅仅是由点突变和DNA重排导致的,这就从根本上给图位克隆工程造成了严重的问题。举例来说,如果在两个株系之间发生倒转的一个大约500 Kb的序列被用于形成的一个作图群体,所有发生在这个倒转内的重组事件将产生不育的减数分裂产物。因此,不可能在这个倒转序列内对突变进行作图。到目前为止,发生在常见株系之间的这样的DNA重排还没有被报道过,确实应该是这样,因为它们很难被检测到。在一个作图实验中,它们的出现将很有可能被忽视直到最后一步。
有时候,T-DNA插入和辐射也被观察到能导致DNA的重排(Shirley等,1992;Nacry等,1998;Laufs等,1999;Ogas等,1999)。因此,当被作图的突变是由这些方法产生的时候,