浙江大学生物化学甲实验课件 实验4 蔗糖酶活力测定——3[1].5-二硝基水杨酸法

实验四蔗糖酶活力测定

——3.5-二硝基水杨酸法

一、实验目的和要求 1、掌握酶活力测定的基本原理和方法； 2、学习酶的比活力的计算。 二、实验基本原理 蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),是一种水解 酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等 量的葡萄糖和果糖(还原糖)。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原 糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊-索模吉(Nelson-Smogyi) 试剂比色法，斐林试剂法等。 本实验采用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖 酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的 氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可 利用分光光度计在500nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、 迅速、杂质干扰较小。

蔗糖酶活力单位(u): 蔗糖酶在室温(50℃), pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖 所需的酶量(ml)。 蔗糖酶比活力的计算： 酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力 单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同 一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较 酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白mg数，即每mg蛋白所含有的酶 活力单位数。 比活力=活力单位/mg蛋白

三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 2、实验试剂 ① 3,5-二硝基水杨酸试剂； 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10%NaOH溶液中，并用水稀释至69ml, 在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放臵7-10天 以后使用。 ② 1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17); ③ 5%蔗糖溶液； ④ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5; 四、实验器材与仪器 1、恒温水浴(25℃、100℃); 2、可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿； 3、试管、试管架； 4、移液管； 5、微量移液器：200μl、 1000μl;

五、实验操作方法和步骤 (一) 蔗糖酶活力的测定 1、标准曲线的制作 按下表加操作：1 2 3 4 5 6 7

葡萄糖(umol/L) H2O 3.5-二硝基水杨酸 (ml) (ml)

0 2.0 1.0

1.0 0.10 1.90 1.0

1.5 0.15 1.85 1.0

2.0 0.20 1.60 1.0

2.5 0.50 1.50 1.0

3.0 0.60 1.40 1.0

3.5 0.70 1.30 1.0

1g/L葡萄糖标准溶液(ml) 0.00

将各管溶液混匀后，在100℃恒温水浴加热5分钟， 取

出立即用冷水冷却至室温 H2O(ml) A5207 7 7 7 7 7 7

将各管溶液混匀

以还原糖(mg数)为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度-吸光值标 准曲线。

2、蔗糖酶的酶活力测定 按下表加样：样 品 编 号 0.2mol/L乙 酸缓冲液(ml) H2O(ml) 空白 1 0.5 1.0 I(1:50 稀释) 2 0.5 0.95 3 0.5 0.8 4 0.5 0.5 Ⅱ(1:50 稀释) 5 0.5 0.95 6 0.5 0.8 7 0.5 0.5 Ⅲ(1:50 稀释) 8 0.5 0.95 9 0.5 0.8 10 0.5 0.5 11 0.5 0.95 Ⅳ(1:10 ) 12 0.5 0.8 13 0.5 0.5

蔗糖酶液(ml)5%蔗糖溶液 (ml) 保温时间 3.5-二硝基 水杨酸试剂 (ml) 蒸馏水 A520

0.00.5

0.050.5

0.20.5

0.50.5

0.050.5

0.20.5

0.50.5

0.050.5

0.20.5

0.50.5

0.050.5

0.20.5

0.50.5

立即混匀后，室温(25 ℃ )保温10分钟

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

在100℃恒温水浴中加热5分钟 7 7 7 7 7 7 7 混匀 7 7 7 7 7 7

(二)实验结果 1、蔗糖酶活力和比活力的计算： 2、蔗糖酶各步纯化样品的纯度比较体 积 (ml) 蛋白浓度 (mg/ml) 活 力 (u/ml) 比活力 u/mg

总蛋白(mg)

总活力u

样品Ⅰ

800

1600

2.0

样品Ⅱ

600

2.5

样品Ⅲ

400

1200

3.0

样品Ⅳ

100

480

4.8

六、结果分析讨论

七、注意事项 1、酶活力测定时，要控制好反应时间，各管的酶反应时间一定要一致，否则 会影响整体结果。 2、加各反应试剂的体积一定要准确，否则也会影响最终结果。

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及蛋白质相对分子质量测定预习参考资料 郭尧君 蛋白质电泳实验技术 科学出版社