061武汉大学生物学院细胞分析试验课件[1]

武汉大学生物学院细胞分析试验课件

第6章真核生物的遗传分析本章重点是：讨论真核生物的基因组、基因定位与染色体作图和真核生物同源重组的分子机制，并介绍基因丢失、扩增与重排及其遗传学效应。

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6.16.1.1 C值悖理

真核生物基因组

一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组( genome)。基因组DNA测序的结果表明基因组中不仅包含着整套基因的编码序列，同时还包含着大量非编码序列，即基因之间的序列。这些序列同样包含着遗传指令(genetic instruction)。因此，基因组(应该)是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。 genome -- The complete set of sequences in the genetic material of an organism. It includes the sequence of each chromosome plus any DNA in organelles.( genesⅨ)

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生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值(C-value)每种生物各有其相对恒定的C值不同物种的C值之间有很大差别能营独立生活的最小的生物——枝原体(Mycoplasma)的C值不到106bp一些显花植物和两栖类动物的C值则可多达1011bp,相差10万倍。 C值同生物的进化有什么关系?生物的C值，即基因组的DNA总量是不是随着生物的进化而相应地增加?

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一方面：在一些低等生物中，随着生物进化，增加了生物体的结构和功能的复杂性，基因组也相应地增大即C值↑。如蠕虫的C值大于霉菌、藻类、真菌、细菌和支原体。

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另一方面：随着进一步的进化，在其他生物中则看不到这种规律。显花植物和两栖类动物的基因组最大两栖类动物 C值小的 109bp大的1011bp软骨鱼、硬骨鱼甚至昆虫和软体动物的基因组都大于包括人类在内的哺乳动物的基因组。爬行类和棘皮动物的基因组大小同哺乳动物几乎相等。

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因此，从总体上说生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C—value paradox)。 C-value paradox: the lack of direct relationship between the C value and phylogenetic complex.人们对C值悖理已经提出许多解释：包括基因组的部分或完全加倍、转座、反转录已加工假基因、DNA复制滑动、不等交换和DNA扩增等，Petrov等又提出一个解释是：各种生物基因组的大小是由于基因组中长期积累起来的过量的非编码DNA被清除的速率不同所造成的结果，即DNA丢失的速率愈慢，那么基因组DNA含量愈高

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6.1.2

N值悖理

N(number of genes)值悖理(N value paradox)物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性，这被称之为N(number of genes)值悖理(N value paradox)或G (number of genes)值悖理。

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面对由基因组测序和注释所揭示出来的线虫、果蝇、植物以及人等的

有关蛋白质编码基因的数目如何进行解释？比如:人的基因组(3300Mb)——25,000个左右的基因；线虫(C. elegans)基因组(97Mb)——19,000个基因；果蝇(D. melanogaster)基因组(常染色质部分的120Mb)——13,600个基因；

啤酒酵母(S. cerevisiae)基因组(12Mb)——约6 000个基因；水稻(O. sativa)基因组(389Mb)——37,544蛋白质编码基因等等。

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非常明显，果蝇基因组比线虫基因组大，进化地位比线虫高，而编码基因反而比线虫少；人的基因组应该是最复杂的，人的进化地位最高，但编码的基因还没有水稻基因组的多。显然，要理解每一个物种发育、代谢、生长、繁殖、行为等等的本质，仅用基因组的序列测定的结果是不能直接地回答这些问题的。在对基因组进行注释后，人们试图用基因组的结构和基因数目的多少来説明基因的功能以及各物种间的关系也不是一个简单的问题。

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6.1.3真核生物基因组DNA序列的复杂度真核生物基因组DNA C值和N值悖理现象都表明其DNA序列的复杂度，为此可通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性。也就是通过DNA的变性(denaturation)和复性(renaturation)反应的动力学过程分析DNA序列的性质，由于复性的速率取决于互补的DNA序列之间的随机碰撞，所以DNA复性是一个双分子二级反应。

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补充(1)序列复杂性(sequence complexity)同一类生物中基因组大小相差悬殊，其主要差别在于“多余”(excess)DNA的量的差别。“多余”DNA量多，则基因组大；反之，则小。所谓“多余”DNA主要是重复序列，即这种DNA序列在基因组中可以有不止一个拷贝。不同序列的总长度称为序列复杂性或者说：DNA分子中不重复碱基的总量(用bp来表示)或者说：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值ATAT例( TATA 40其总长为160bp,但不重复的碱基：AT ) ATCG

所以

序列复杂性 x= 2 (bp)序列复杂性 x= 4(bp)

而(TAGC ) 40

若一个DNA分子长度为106bp,完全不含重复顺序，则 x=106(bp)

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(2) DNA复性动力学基因组内单一序列和重复序列的组成情况，可通过DNA复性动力学研究来确定。 DNA复性:当变性DNA的两条互补链在除去变性因素后，可以重新或部分恢复成双螺旋结构。复性的必要条件：足够的盐浓度;温度适中(低于Tm 20-25℃)复性过程缓慢：成核作用→拉链作用当两条单链DNA接触时，如果某个区段可以互补配对，就先形成一个双链核心区，然后扩展其互补配对区段而复性形成双链。复性过程很复杂，但基本符合二级反应动力学 dS DNAk1 k2

2SS

DNA

复性的速率可用下列公式表示： dC/dt=-kC2

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这里，C是在t时单链DNA的浓度，k是二级反应常数。上述

公式可以重排为 -dC/C2=kdt对上式积分整理得: C/C0= 1/(1+kC0t)

这里C0是 t=0时DNA的初始浓度这个公式表明反应中单链DNA所占百分数(C/C0)是DNA浓度(C0)同反应时间 (t)乘积的函数，通常用C0t来表示。在一个特定的实验中，C0是已知的，C是可以测定的，如C/C0对 C0t作图可以得到下图的曲线，称为Cot曲线(见图5—4)。当C/C0=0.5即复性反应完成一半时(t1/2)的Cot值定义为 C0t1/2

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基因组A的C0 t1/ 2基因组B的C0 t1/ 2=基因组A的核苷酸对数基因组B的核苷酸对数

基因组B的C0 t1/ 2基因组A的C0 t1/ 2=基因组A的核苷酸对数基因组B的核苷酸对数

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当条件一定时： C0t½的大小与DNA的分子量及复杂性有关 (1)C0t½越大，表示复性速度越慢，DNA的分子量越大 DNA总量一定时，基因组越复杂，任何特定顺序的拷贝数就越少。例如，DNA起始总量为12pg,一种细菌基因组大小为0.004pg,则它的各种顺序有：12/0.004=3000拷贝。另一种真核生物基因组大小 3pg, 12/3=4拷贝。尽管测得的 Co绝对量相同12pg (核苷酸 mol/L)。而事实上后者各顺序的浓度比前者低了3000/4=750(倍)。要使该真核生物基因的拷贝数也达到3000,则要多加750倍的DNA.因此,该真核生物DNA复性反应的C0t½是细菌DNA反应C0t½的750倍。

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(2)在不存在重复序列的情况下,C0t½值与基因组的大小成正比,也即与反应体系中的复杂度成正比: X=K’C0t½ A.在一般标准条件下(阳离子浓度为0.18 mol/L,片段大小为400bp) K’=5 x 105则有: X= 5x105 C0t½