沉淀法分离纯化蛋白质综述

沉淀法分离纯化蛋白质综述 摘要：蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法， 是当代生物产业当中的核心技术。分离纯化蛋白质的方法有沉淀法、电泳法、透析法、层析法及高速离心法。根据蛋白质的溶解性质，利用沉淀法对其分离纯化方式进行综述。

关键词：蛋白质 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法

蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质具有巨大的商业价值，广泛应用于医药、食品、食品添加剂、纺织、制革、工业催化剂等领域。从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。而蛋白质分离纯化是当代生物产业当中的核心技术，该技术难度、成本均高。根据蛋白质的酸碱性质、分子大小与形状、溶解性质及其与配体亲和性等性质可对蛋白质进行分离纯化。沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相的过程。在生物工业、有机化工偶那个专业、无机化工工业及实验室分析中是分离与纯化最常用的方法之一。常用的蛋白质沉淀法有盐析法、有机溶剂沉淀法及等电点沉淀法，实际工作中常联合使用这三种沉淀法以达到较高的蛋白质分离提纯的效果。

1. 盐析法

蛋白质在高盐浓度下发生盐溶，这是因为当向蛋白质溶液中加入中性盐到一定浓度时，蛋白质表面电荷被大量中和，即亲水基团被大量中性盐离子所包围，水分子离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用使蛋白质分子相互聚集而沉淀。盐析的一般操作步骤是，选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25%饱和度的硫酸铵）使部分杂质呈“盐析”状态从溶液中沉淀出来，经离心去除。而目的的蛋白质呈盐溶状态，而从溶液中分离出来。盐析的影响因素包括蛋白质浓度、溶液pH值及温度。当蛋白质浓度较低时，发生盐析需要较高的离子浓度；当pH值为蛋白质的等电点时，蛋白质分子上的净电荷数为零，溶解度最小；较高的温度有利于盐析沉淀，但较高温度易使蛋白质变性和发生共沉作用。

因此反应过程中应调控好这些影响因素，减少其对蛋白质分离提纯效果的负影响。盐析沉淀法是生化制药中应用最多的沉淀方式。

2. 有机溶液沉淀法

有机溶液沉淀法是当蛋白质水溶液加入一定量与水互溶的有机溶剂，降低溶 质的溶解度，使其沉淀析出的分离提纯方法。该沉淀法的反应机理是水溶性有机溶剂加入溶液后降低了戒指的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。同时，水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层得厚度，减低了它的亲水性，导致脱水凝集。该方法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品级以上的蛋白质，且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。但容易使蛋白质失活，且有机溶剂易燃易爆，安全要求高。常用的有机溶剂有乙醇及丙酮，例如在鸡卵粘蛋白的分离定量实验中，采用的有机溶剂为-20℃的丙酮，缓慢加入，且边加边搅拌。蛋白质在有机溶剂中的溶解度随温度、pH和离子强度有关。保持实验在低温环境下进行，有利于防止蛋白质变性及提高收率；调控溶液pH值，避免目标蛋白与杂质共沉，将pH调控在等电点附近比较好；离子强度大，有利于沉析。在有机溶剂中添加浓度为0.5mol/L左右的中性盐可增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果。

3. 等电点沉淀法

等电点沉淀法是两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷 为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，分子间静电斥力减小，溶解度降低。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定p H 值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的p H 值来分离纯化蛋白质。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作，是一种高分辨率的蛋白质分析分离技术。该方法使用于疏水性较强的蛋白质，例如酪蛋白等，处于等电点时能形成粗大的凝聚物。在调节等电点时，如采用盐酸、氢氧化钠等强酸强碱要防止蛋白质变性。

总结：蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即使是同类蛋白质，因选用

材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但在实际工作中，分离提纯蛋白质的过程较繁琐，往往要综合几种方法方可提纯出一种蛋白质。提纯某种蛋白质时，首先要明确分离纯化的目的，了解目的蛋白质的性质，在原有的基础上进一步优化分离提纯方法，以求达到产品纯度和总回收率双高的理想效果。在对蛋白质的研究过程中，对其分离提纯方式的改进不断地提高蛋白质分离纯化技术，降低成本，同时促进对蛋白质性质的研究，增进了人们对蛋白质性质的认识，为人类社会创造了宝贵的物质及精神财富，对生命科学的进步和人类的发展作出重大贡献。

参考文献：

[1]翁志清,张英锋.蛋白质的盐溶、盐析和变性.中学生数理化(高二版) 2007;05

[2]胡天桥,蒋智华,覃健,臧宁,何敏.人血清小分子蛋白质分离中等电点沉淀法的探索.《中国卫生检验杂志》.2009;02

[3] 许亚军,林俊岳. 蛋白质提纯研究进展[J ] .天津化工,2006 ,20