PEG_四水合酒石酸钾钠双水相法萃取发酵液中的谷胱甘肽

第2期

2010年4月

第10卷

中国食品学报

JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology

Vol．10No．2Apr．2010

PEG/四水合酒石酸钾钠双水相法萃取发酵液中的谷胱甘肽

吴祥庭

徐

帅

浙江温州325000）

（浙江温州大学生命与环境科学学院

摘要

采用PEG/盐的双水相系统，从离心除菌后的发酵液中萃取谷胱甘肽，考察PEG分子质量、盐、PEG浓

度、四水合酒石酸钾钠浓度、pH、环境温度、发酵液加入量对谷胱甘肽萃取率的影响。采用响应面分析法优化试验条件，结果表明，选用PEG/四水合酒石酸钾钠双水相系统的最佳提取条件：PEG（15%）/四水合酒石酸钾钠（13%）双水相溶液10mL、pH6.7、温度63℃、发酵液加入量1mL。此时谷胱甘肽分配系数K为3.5，萃取率

84.13%，该方法可行。

关键词文章编号

双水相；萃取；分离；谷胱甘肽；响应面分析

1009-7848（2010）02-0083-06

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的具有重要生理功能的天然活性三肽，在自然界中以氧化型（GSSG）和还原型（GSH）的形式广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。经研究发现还原型的谷胱甘肽在生物体内具有重要的生理功能[1]。谷胱甘肽在临床应用上作为重要的解毒药物，在肿瘤、眼角膜病治疗、抑制艾滋病病毒等方面应用广泛[2]，同时在食品添加剂、化妆品和运动营养品中的应用成为研究热点。

2000、4000、6000），上海师大化工厂；四水合酒

石酸钾钠、硫酸铵、碳酸钠、硫酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾（分析纯），汕头金砂化工厂。

紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；阿贝折射仪，上海浦东物理光学仪器厂；台式离心机，上海安亭科学仪器厂；电子恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1双水相体系制备

先将PEG配成质量分

GSH的生产方法主要有直接溶剂萃取法[3]、发酵法[4]、酶法[5]及化学合成4种方法。而采用双水相萃取GSH的研究较少。双水相萃取从发现至今由于

其自身的优点[6]，目前已广泛用于提取蛋白质[7]、酶

[8]

数50%的储备液，然后与各种盐溶液混合配制成不同比率的双水相体系溶液。

1.2.2磷酸缓冲液的制备根据不同的pH，依照

亨-哈方程计算HPO42-与H2PO4-的比率，配制不同

、色素[9]等。本文采用双水相体系萃取酵母发酵液

中的谷胱甘肽。利用谷胱甘肽在双水相中的不同分配，达到与发酵液中其它杂质分离的目的。应用响应面分析法优化双水相提取GSH的条件，从而确定最佳GSH提取工艺。

pH的质量分数为30%的磷酸缓冲液。

1.2.3分析谷胱甘肽含量测定：采用ALLOXAN

试剂衍生法[10]。

固形物含量测定：采用阿贝折光计法。

1.2.4计算

（1）R=Vt/Vb

式（1）中，Vt———上相体积（mL）；Vb———下相

1

1.1

材料和方法

材料与主要仪器

体积（mL）；R———相比。

（2）K=Ct/Cb

式（2）中，Ct———上相质量浓度（g/L）；Cb———下相质量浓度（g/L）；K———分配系数。

Yt=RK/（1+RK）〔即：萃取率=上相谷胱甘肽质量（mg）/发酵液总谷胱甘肽质量（mg）〕。（3）

L-谷胱甘肽、ALLOXAN试剂，sigma公司；聚

乙二醇PEG（分析纯，平均相对分子质量1500、

收稿日期：2009-04-28

基金项目：浙江省科技项目（No.2006C30050）作者简介：吴祥庭，男，1965年出生，副教授

84

中国食品学报

试验方法单因素试验

影响双水相法萃取谷胱甘

2010年第2期

1.2.51.2.5.1

试验。通过2水平试验设计得到的3个重要因素，做3因素3水平的响应面分析试验。运用SAS的响应面回归进行响应曲面分析（responsesur-

肽的因素很多，如不同分子质量的PEG，与PEG组成双水相的不同盐，组成双水相的盐浓度，pH，温度，发酵液量等。在响应面分析前，先做单因素试验选取试验因素与水平。

facemethodology，RSM），建立二次响应面回归模

型。分析拟合的回归方程，确定最优工艺参数及最优响应因子水平。响应面法的分析的因素与水平见表1。

表1

响应面法分析因素及水平

水平

①PEG的分子质量对分配系数与萃取率的影

响

取平均分子质量为1500、2000、4000、6000的PEG（13%）-四水合酒石酸钾钠（13%）双水相液，发酵液1mL，pH5，温度45℃，自然分相5min（下同）。

Table1

因素

AnalyticalfactorsandlevelsforRSM

－1124.035

0156.055

＋1188.075

②不同物质对谷胱甘肽萃取率影响

配制10%PEG-15%硫酸铵，15%PEG-10%

硫酸铵；10%PEG-15%四水合酒石酸钾钠，15%

X1（EG%）X2（pH）X3（温度/℃）

以Yt%为参考指标做试验

。

PEG-10%四水合酒石酸钾钠；10%PEG-15%碳酸

钠，15%PEG-10%碳酸钠；10%PEG-15%硫酸钠，

15%PEG-10%硫酸钠的双水相液10mL，发酵液1mL，pH5，温度45℃。

③PEG/四水合酒石酸钾钠浓度对分配系数与

萃取率影响

配制PEG（9%）-四水合酒石酸钾钠（17%）、

2结果与讨论

2.1单因素试验

2.1.1PEG的分子质量对分配系数与萃取率的影

响

由图1可知，随着PEG分子质量的增大，萃取率和分配系数增大，这是由于聚合物的疏水性随分子质量的增大而增强，当PEG的分子质量增大时，小分子的谷胱甘肽易被高分子质量的高聚物所吸引，从而不断向上相分配，使K值增大。因此PEG分子质量选取6000为宜。

PEG（11%）-四水合酒石酸钾钠（15%）、PEG（13%）-四水合酒石酸钾钠（13%）、PEG（15%）-四水合酒石酸钾钠（11%）、PEG（17%）-四水合酒石酸钾钠

（9%）的双水相液10mL，发酵液1mL，pH5，温度

45℃。

④pH对分配系数与萃取率影响

配制PEG（13%）-四水合酒石酸钾钠（13%）的双水相液10mL，发酵液1mL，pH分别为4、5、6、7、8，温度45℃。

⑤温度对分配系数与萃取率影响

配制PEG（13%）-四水合酒石酸钾钠（13%）

的双水相液10mL，发酵液1mL，pH6，温度分别

25、35、45、55、65℃。

⑥发酵液的加入量对分配系数与萃取率影响

配制PEG（13%）-四水合酒石酸钾钠（13%）的双水相液10mL，发酵液加入量分别为1、2、3

mL，pH6，温度55℃。

1.2.5.2Box-Behnken响应面分析Box-Behnken的中心组合设计适用于2～5个因素的优化设计和

第10卷第2期PEG/

四水合酒石酸钾钠双水相法萃取发酵液中的谷胱甘肽85

2.1.2不同物质对分配系数与萃取率影响由图

2可知，选取10%与15%的PEG与不同盐组成不

同浓度的双水相系统，谷胱甘肽的萃取率也不同。

PEG-四水合酒石酸钾钠双水相系统比其它组合的萃取率高，所以选用PEG-四水合酒石酸钾

钠双水相系统。

2.1.3

PEG-四水合酒石酸钾钠浓度对分配系数

与萃取率的影响由图3可知，随着PEG-四水合

酒石酸钾钠质量分数比值的增大，萃取率与分配系数增大，当PEG13%/四水合酒石酸钾钠13%时萃取率与分配系数最大，然后随着质量分数比

值的上升而下降。这是因为高聚物浓度增大，分配系数增大，达到最大值后便逐渐降低，表明上、下相中PEG与四水合酒石酸钾钠的质量分数对谷胱甘肽活度系数有较大影响，使K值偏离临界点并大于1，所以选取PEG（13%）-四水合酒石酸钾钠（13%）质量分数比为1。

降，其原因是OHˉ增多，界面电位增大，谷胱甘肽的分配系数下降，所以选取pH6.0为宜。

2.1.5温度对分配系数与萃取率的影响由图5

可知，随着温度的上升，萃取率与分配系数增大，当温度55℃时萃取率最高，随后萃取率下降。这是因为温度变化影响物理性质，如黏度和密度，从而影响谷胱甘肽的分配。温度在临界点附近，温度对相图的影响最显著，对分配系数的影响最大，所以选取温度55℃。

2.1.4体系pH对分配系数与萃取率的影响由

图4可知，pH低于6.0时，随着pH的增大，萃取率与分配系数也增大，这是由于体系pH值影响谷胱甘肽表面的电荷数，从而影响分配。pH值增大，使HPO42-增多，界面电位趋向于零，谷胱甘肽的分配系数增大，当pH6.0时分配系数达到最大值，随后pH值继续增大，萃取率与分配系数下

2.1.6发酵液加入量对分配系数与萃取率的影响

由图6可知，取发酵液1、2、3mL，萃取率在

78.8%～83.7%之间，分配系数2.0～3.5，结果表明发

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中国食品学报

2010年第2期

表2响应面法试验设计与结果

Table2

试验号

Experimentaldesignandresultsof

RSMX10000-1-111-1-111000

X2-1-1110000-11-11000

X3-11-11-11-110000000

Yt/%71.0075.3580.5181.4972.8083.4577.3080.1475.7678.7477.7679.2983.5684.2383.01

123456789101112131415

0.36X1X2-3.32X22-1.95X1X3-0.92X2X3-2.78X32

根据表3、表4响应面分析可以得出，预测值为最大值。萃取条件：PEG15%、pH6.7、温度63℃。平行3次，取平均值。在此条件下GSH萃取

率为83.78%，分配系数K3.5，与模型的预测值基本符合。分离后上相中其它固形物杂质与下相比为1/5，说明萃取后上相与杂质的分离效果较好。

酵液的加入量对萃取率的影响不大。因1mL发酵液萃取效果好，故选取1mL发酵液。

2.2响应面分析

由于单因素试验表明发酵液加入量对分配系

数与萃取率影响不大，而PEG浓度、pH、温度对萃取率影响较大，所以对这3个因数的萃取条件进行优化。

以提取率为响应值，根据表5的试验结果，用

Statistica统计分析软件进行多元回归分析，结果见表2、图7～图9。

对试验数据进行多项式拟合回归，以GSH

萃取率Y为因变量，PEG质量分数比（X1）、pH（X2）、温度（X3）为自变量建立回归方程：

Y=83.27+0.46X1+2.56X2+2.32X3-2.06X12-

第10卷第2期PEG/

四水合酒石酸钾钠双水相法萃取发酵液中的谷胱甘肽87

表3

方差来源

回归残存总离差线性相关系数

自由度

回归方程的方差分析

Table3Varianceanalysisofregressionequation

平方和

均方差

F值4.12

Pr>F0.0668

95140.8811

190.37977725.690117216.069894

21.1686555.138023

表4回归模型的预测值

Table4Predictivevalueofregressionmodel

X114.687443

X26.672122

X362.936868

Yt/%84.131397

点的类型最大值

3结论

利用双水相法从离心除菌后的发酵液中提取

谷胱甘肽是可行的，与传统的提取方法———热水法相比，可实现一步到位、快速分离，并且在实际生产中节省成本，具有很好的工业应用前景。选择

PEG-四水合酒石酸钾钠双水相系统的最佳提取

条件：PEG（15%）-四水合酒石酸钾钠（13%）的双水相溶液10mL、pH6.7、温度63℃、发酵液1mL，

谷胱甘肽萃取率为84.13%，分配系数K为3.5。

参考文献

[1]OrreniusS，MoldensP.Themultiplerolesofglutathioneindrugmetabolism[J].TIPS，1984，（5）：432-435.[2]沈亚领，李爽，迟莉丽，等.谷胱甘肽的应用与生产[J].工业微生物，2000，30（2）：41-45.

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2010年第2期

[3]潘飞，邱雁临，黄欣.啤酒废酵母中谷胱甘肽的抽提新方法的探讨[J].生物技术，2005，15（4）：50-52.[4]刘娟，刘春秀，王雅琴，等.发酵生产谷胱甘肽的研究进展[J].微生物学通报，2002，29（6）：72-75.[5]陶锐，吴梧桐，许激扬.酶法制备谷胱甘肽工艺的研究[J].药物生物技术，1999，6（4）：203-207.

[6]Giraldo-ZunigaAD，CoimbraJSR，MinimLA，etal.AxialmixinginaGraesserliquid-liquidcontactorusing

aqueoustwo-phasesys-tems[J].Chem.Eng.Process，2005，44：441-446.

[7]ChethanaS.Newaqueoustwophasesystemcomprisingpolyethleneglycolandxanthan[J].BiotechnologyLetters，

2006，28：25-28.

[8]RavindraBabuB，RastogiNK，RaghavaraoKSMS.Liquidextractionofbromelainandpolyphenoloxidaseusing

aqueoustwo-phasesystem[J].ChemicalEngineeringandProcessing，2008，47：83-89.

[9]ChethanaS.Aqueoustwophaseextractionforpurificationandconcentrationofbetalains[J].FoodEngineering，2006，

81：679-687.

[10]李寅，陈坚，周楠迪，等.氨基酸和酵母膏对谷胱甘肽发酵的影响[J].中国医药工业杂志，1998，29（12）：537-542.

·ApplicationofPEG/C4H4O6KNa4H2OAqueousTwo-phaseSystemtoExtract

GlutathionefromFermentationBroth

WuXiangting

XuShuai

（SchoolofLife&EnvironmentalScience，WenzhouUniversity，Wenzhou325000，Zhejiang）

·AbstractTheworkattemptedtostudyandoptimizetheaqueoustwo-phasesystems（PEG/C4H4O6KNa4H2O）toex-

tractGlutathionefromfermentationbroth，inwhichthecellwasremovedbycentrifugation，theinfluenceofseveralpa-rameterssuchasphaseformingpolymermolecularweight，concentrationofphaseformingcomponents（polyethyleneglycol，C4H4O6KNa·4H2O，fermentationbroth），pHoftheC4H4O6KNa·4H2Obuffersolutionandtemperatureondifferentialparti-tioningofGlutathionerequiredfortheextractionrateandpartitioncoefficientwerestudied.Responsesurfacemethodologymethodwasappliedtodeterminetheeffectofcentralcompositeexperimentdesign，Theresultsshowedthattheconstitut-ed15%PEG6000with13%C4H4O6KNa·4H2OandSolution10mLbytheaqueoustwophasesystemwith1mLfermenta-tionbrothattheconditionsofpH=6.7andthetemperature63℃.Thepartitioncoefficientsobtainedas3.50andtheex-tractionratewas84.13%，Thustheaqueoustwo-phasesystem（PEG/C4H4O6KNa·4H2O）provideanewmethodforsepara-tionofGlutathione

Keywords

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aqueoustwo-phasesystem；extraction；partition；Glutathione；responsesurfacemethodology

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政策法规

卫生部批准DHA藻油、棉籽低聚糖等7种物品为新资源食品

2010年3月9日，卫生部公布了DHA藻油、棉籽低聚糖、植物甾醇、植物甾醇酯、花生四烯酸

油脂、白子菜、御米油等7种物品为新资源食品，允许玫瑰花（重瓣红玫瑰Roserugosacv.Plena）、凉粉草（仙草MesonachinensisBenth.）作为普通食品生产经营，允许夏枯草（PrunellavulgarisL.）、布渣叶（破布叶MicrocospaniculataL.）、鸡蛋花（PlumeriarubraL.cv.Acutifolia）作为凉茶饮料原料

使用。生产经营上述食品应当符合有关法律、法规、标准规定。

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