蛋白质的等电点测定与沉淀反应

实验7 蛋白质的等 电点测定和沉淀反 应

I. 蛋白质等电点测定 一、目的： 目的： 了解蛋白质的两性解离性质 学习测定蛋白质等电点的一种方法

二、原理： 原理：蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡： 蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：+ OH+ H+ NH3+ COO+ OH+ H+ NH2 COO-

Pr

NH3

+

Pr

Pr

COOH

pH< pI净电荷为正

pH = pI净电荷=0 净电荷

pH > pI净电荷为负

蛋白质等电点：当蛋白质颗粒上正负电荷 蛋白质等电点： 数目相等时溶液的pH值 数目相等时溶液的 值。 处于等电点时的蛋白质在电场中不发生移 动；处于等电点时的蛋白质溶解度最低。 处于等电点时的蛋白质溶解度最低。 用醋酸与醋酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶 用醋酸与醋酸钠( 液中)配制成各种不同 值的缓冲液 值的缓冲液。 液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向缓 冲液溶液中加入酪蛋白后， 冲液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓 冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 冲液的 值即为酪蛋白的等电点。 值即为酪蛋白的等电点

三、器材1.水浴锅 2.温度计 3.200毫升锥型瓶 4.100毫升容量瓶 4.100 5.吸管 6.试管 7.试管架 8.乳钵

四.试剂: 1. 2. 3. 4. 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 1.00mol/L醋酸溶液 0.10mol/L醋酸溶液 0.01mol/L醋酸溶液 200毫升 100毫升 100毫升 50毫升

五.操作方法取4支同样规格的试管，按下表顺序加入各试 剂，然后混匀，静置10分钟，观察现象。试 管 号 蒸馏 水 (ml) 0.01mo 0.1mol/ 1.0mol 酪蛋白 产生 l/L醋酸 L醋酸 /L醋酸 醋酸钠 混浊 (ml) (ml) (ml) 溶液(ml) 否?

1 2 3 4

8.4 8.7 8.0 7.4

0.6 - - -

- 0.3 1.0 -

- - - 1.6

1 1 1 1

最浑浊的一管的pH为酪蛋白的等电点。

六.等电点测定实验结果几号管最混浊,溶液pH为?由于等电点 时蛋白质溶解度最小,所以酪蛋白的等电点 , 为?

Ⅱ.蛋白质的沉淀反应 蛋白质的沉淀反应 一、目的： 目的： 1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。

二、原理： 原理： 蛋白质分子表面的水化层和双电层是蛋白 质水溶液稳定的两个重要因素。用一定的 用一定的 理化因素处理可破坏蛋白质颗粒表面的水 化膜或中和表面电荷而使蛋白质沉淀。 化膜或中和表面电荷而使蛋白质沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 (1)可逆的沉淀的反应：蛋白质不变性 (2)不可逆沉淀反应：蛋白质变性

三、器材及试剂： 器材及试剂：1. 蛋白质溶液 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清∶水=1∶9) 2. pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液 3. 3%硝酸银溶液 4. 5%三氯乙酸溶液 5. 95%乙醇 6

. 饱和硫酸铵溶液 7. 硫酸铵结晶粉末 8. 0.1 mol·L-1盐酸溶液 9. 0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液 10. 0.05 mol·L-1碳酸钠溶液 11. 0.1 mol·L-1醋酸溶液 12. 甲基红溶液 13. 2%氯化钡溶液

四、操作步骤1.蛋白质的盐析 无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等) 的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也 不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱 和硫酸铵溶液中才能析出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再 溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸 铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少 量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中 内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止， 此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。

2.重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质 结合成不溶于水的复合物。 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml,再加3%硝酸 银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片 刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀 是否溶解？为什么？ 3.某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋 白质溶液2 ml,再加1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡 试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液， 向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 4.有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2 ml蛋 白质溶液，再加入2 ml 95%乙醇。混匀，观察沉 淀的生成。

5.乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号。依下表 顺序加入试剂试剂 5%卵清 0.1 mol·L-1 -1 (ml) 蛋白溶 氢氧化钠 0.1 mol·L 盐酸溶液 管号 溶 液 液 1 2 3 1 1 1 - 1 - - - 1 95%乙 醇 pH4.7 缓冲溶 液 1 - -

1 1 1

振摇混匀后，观察各管有何变化。 放置片刻，向各管内加水8 ml,然后在 第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别 用0.1 mol·L-1醋酸溶液及0.05 mol·L-1碳 酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化 和沉淀的生成。每管再加0.1 mol·L-1盐 酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释 各管发生的全部现象。

五.蛋白质沉淀实验结果 蛋白质沉淀实验结果沉淀 方法 盐析 重金属 离子 有机酸 有机 溶剂 5%卵 清蛋白 2ml 2ml 2ml 2ml 试剂 硫酸铵溶液 3%AgNO3 5%三氯乙酸 9 5%乙醇 沉淀溶 观察现象 解情况 为什么