鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

研究从鸡输卵管组织提取细胞总RNA,根据Gene Bank中已发表的鸡溶菌酶基因序列,设计合成特异引物,合成cDNA序列,并以此为模版,PCR扩增鸡溶菌酶基因。用Xho I和Xba I对LYZ基因的PCR产物和真核表达载体pPIC6αA进行双酶切后转化到大肠杆菌(DH5α)中,构建成为真核重组表达载体pPIC6αA-LYZ。该载体经PstXI酶切线性化后,以电击转化方法导入到毕赤酵母宿主菌X-33中,经Blasticidin抗性

维普资讯 http://

《饲斟工业》2 0年囊 2鞠 0 7 8

2 4

鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究权志中张丞斌 余荣刘长江

摘要研究从鸡输卵管组织提取细胞总 R A,据 G n ak中已发表的鸡溶菌酶基因序列， N根 e eB n 设计合成特异引物，合成 c N D A序列，并以此为模版，C P R扩增鸡溶菌酶基因。用 X oI X aI h 和 b对

L Z基因的 P R产物和真核表达载体 pI6￣行双酶切后转化到大肠杆菌(H 0中， Y C PC e A进 D 5￣构建成为真 )核重组表达载体 p I 6￣— Y。载体经 Pt酶切线l化后， PC c L Z该 A s I X}生以电击转化方法导入到毕赤酵母宿主

菌x3一 3中， Batii抗性筛选，经 1 idn sc得到鸡溶菌酶基因重组毕赤酵母菌株；甲醇 9 (酵罐诱导 10 ) 6h发 0 h诱导表达， We m— lt测分析，因重组工程菌株摇瓶诱导表达溶菌酶的表达量约为 4mg,经 t bo检 e基 ,发 l

酵罐诱导表达的表达量约为 1 g。 0m/ l关键词溶菌酶；克隆；表达；赤酵母毕Q5 5中图分类号

溶菌酶 ( szm )由英国细菌学家 Fe ig于 1 oy e是 y lm n

p I 6￣ PC c A真核表达载体中含有的仅 fc r一at,可实 o现胞外分泌表达，毕赤酵母自身分泌极少的胞外蛋而

12 9 2年首先在人的眼泪和唾液中发现的，因其具有溶菌作用，被命名为溶菌酶。它广泛存在于动物、物植和微生物中，一种天然的抗菌剂，特异性地作用是能

向，常有利于表达蛋白的分离纯化。毕赤酵母表达非鸡蛋清溶菌酶，国外虽有报道，国内还没有这方在但

于细胞壁 N一乙酰葡萄糖胺 ( ae l u 0a ie N— ct g csm n, ylN G和 N乙酰胞壁酸 (— ctl ua i ai, A A )一 N ae m rm c cd N M) y

面的研究。本研究将鸡的溶菌酶基因通过克隆、重组、 诱导等手段在毕赤酵母中成功地表达了有活性的鸡蛋清溶菌酶。1材料与方法

之间的 B 14糖苷键，坏肽聚糖支架，微生物细一，破使

胞在内部渗透压的作用下涨裂，细胞质外泄，终导最致细胞死亡。溶菌酶对革兰氏阳性

菌和部分革兰氏阴性菌有很好的抑菌作用，对入和动物的细胞则不发生溶菌作用， WH被 O和许多国家认定为无毒、害、无安全的添加剂 .被越来越广泛地应用于医药、生物技术、 食品以及动物生产中。目前溶菌酶主要从蛋清中提

11试验材料 .

成年产蛋鸡购白农贸市场；质粒 p I 6 A、 .o PC a EC l i

D 5￣巴斯德毕赤酵母 (i i ps f ) H c及 Pc a ati菌株 x一 3 h os 3均购自 Ivt gn公司： T P R试剂盒购自 Po ea n ioe r R—C rm g公司： C引物由上海桑尼生物公司合成；各种限制 PR

4D A连接酶购自 T k r aaa公司、量质取，由于来源有限，产工艺复杂，菌酶产量十分有性内切酶和 T N生溶限，而且价格居高不下，以满足越来越大的市场需粒 D A抽提试剂盒购自 Q A E难 N I G N公司； I pe pn Q A r si p求。利用分子生物技术构建基因工程菌，通过发酵手质粒 D A纯化试剂盒购自上海天根生化科技有限公 N

段生产溶菌酶，是提高溶菌酶产量，将降低成本的有效真核表达系统。表达载体上有一个醇氧化酶强启其动子 A X1可以甲醇作为唯一碳源诱导外源蛋白的 O,

司：C P R产物凝胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物海生物工程公司1试验设备 - 2

效手段之一。毕赤酵母表达系统是近年发展迅速的高基因技术有限责任公司；鸡蛋清溶菌酶标准品购自上

高效表达。到目前为止 .已经成功地表达了近百种外源蛋白。

P C 10P R仪购自美国 BoR d公司" p n o T一0 C i a -, e dr E p f cnrue5 1D和 E p n o etfg 4 7 e tfg 4 5 i p e dr cn6ue 5 1R低温 f

高速离心机购自德国 E pn o公司； ak n低温 p ed f B cma

高速离心机购自美国 B c m n司； ak a公电泳仪购自天龙e权志中，阳农业大学食品学院，士，1 1 1沈阳市东沈博 10 6, 生物技术有限公司：恒温摇床购自美国 Nw陵区东陵路 10号。 2 张丞斌，浙江工业大学生物与环境工程学院。 余荣，州康德权科技有限公司。杭刘长江，单位及通讯地址同第一作者

。收稿日期： 0 7 1— 2 2 0— 1 1

Busi c nic司；恒温培养箱购自上海恒科 rnwc Si ti公 k e f有限公司；凝胶成像仪为 T N N G S2 1。 A O I 0 0连接反应

仪为 A T C BokIc btr I 5 5脱色摇床购自 S E lc u a 一 1 A; n oB江苏海门麒麟医用仪器厂：转膜仪购自美国 Bo R d i a—

公司：0L发酵罐购自镇江东方生物工程设备技术公 3

http://