软琼脂集落形成实验

给你找了几个试验方法：

1.双层软琼脂集落形成率实验

于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细 胞数×100 % = 克隆形成率) 。

2.软琼脂克隆形成实验 将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.

软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%

对照组克隆数-实验组克隆数

抑制率= ×100%

对照组克隆数

3.软琼脂克隆形成实验 用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.

4.软琼脂克隆形成试验 细胞在 35 mm的平皿中长至 70％～80％铺满，然后与 20 μμmol· I-1的AS－ODN。共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制 6mL· L-1的底层琼脂，lml／孔加入 24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL· L-1的琼脂混合，以每孔 0.5 mL中含 500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养 2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。

可以用不同密度细胞绘制标准曲线后测细胞密度，也可直接用OD值绘制生长曲线，MTT法具体步骤如下： MTT比色试验:

A. [概述]

四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法.试验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料,化学名3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐,商品名是噻唑蓝,简称为MTT。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物formazan并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的formazan，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定起光吸收值，可间接反映活细胞量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、无放射性污染、与其他检测细胞活力的方法（如细胞记数法、软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验等）有良好的相关性。

B. [用品]

（1）MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml PBS（0.01mol/L，pH7.4）在电磁力搅拌机上搅拌30min（普通环境中操作），0.22μm的微孔滤膜除菌（超净台内操作），分装，4℃保存。两周内有效。

（2）含10%胎牛血清RPMI1640培养液，0.25%胰蛋白酶消化液，二甲基亚砜（DMSO，使用分析纯产品）。

（3）96孔培养板，单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板。可调移液器、

吸管、离心管、记数板。

（4）CO2孵箱，显微镜，震荡混合仪，酶联免疫检测仪。

C.[步骤]

（1）接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200μl。

（2）培养细胞：将培养板放入CO2孵箱，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养3～５天（培养时间取决于实验目的和要求）。

（3）呈色：培养3～5天后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000prm，5min），然后弃去孔内培养液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，使formazan充分溶解。

（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，纪录结果。以时间为横轴，光吸收值（A）为纵轴绘制细胞生长曲线。

D. [注意事项]

（1）选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一个孔内贴壁细胞长满时约有105个细胞，但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。

（2）避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响试验孔的吸光值。由于试验本底增加，会降低试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

（3）设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤完全相同。最后比色时以空白孔调零。