抗体ProteinA纯化方法

抗体ProteinA纯化

一． ProteinA柱子的制备

1. 配制溶液；

结合／洗涤缓冲液：NaCl，0.5M ；Na2HPO4 ，20mM ；PH8.0。

配制500ml的方法：

称取NaCl 4.383g，Na2HPO4 3.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。

2. 制备空柱子

（1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。

（2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。

（3）在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。

（4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。

（5）加入5ml的ProteinA到柱子中。

（6）

（7）

（8）

二．纯化步骤

1.

2.

3.

4.

5. 样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。 平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。 收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中不含蛋白。

测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。（注意：收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活）

6. 柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。

7. PBS透析收集的抗体。

三．试剂的制备

1. 结合缓冲液1000ml 500ml

甘氨酸 112.6g 56.3g

氯化钠 175.2g 87.6g

氢氧化钠调PH至9.0

2. 洗脱缓冲液500ml