荧光定量PCR技术培训-康为20100806

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实时荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR技术 PCR 原理、 原理、应用及实践Real time QuantitativePCR) (Real time Quantitative PCR北京康为世纪生物科技有限公司

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我们的目标：中国的 我们的目标：中国的Invitrogen

完善的产品线

一站式的服务平台2

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北京康为世纪生物科技有限公司 完善的产品线分子 生物学核酸提取 PCR、RT-PCR 及荧光定量 及荧光定量PCR 、 DNA 分子量标准 克隆与转化 蛋白提取与纯化 蛋白定量、蛋白Marker及蛋白电泳产品 蛋白定量、蛋白 及蛋白电泳产品 Western Blot产品 产品

蛋白质 学相关

免疫学 相关

免疫组化产品、 免疫组化产品、免疫沉淀 标签抗体 内参抗体 二抗3

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五大平台 一站式服务

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泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发 与生产公共服务平台园区公共服 务平台

2010年康为世纪公司依托江苏 年康为世纪公司依托江苏 省泰州市政府及中国医药城的 支持政策，成立江苏康为世纪， 支持政策，成立江苏康为世纪， 主要进行创新的临床诊断试剂 的研发、 的研发、生产与相应的技术服 务， 占地面积约3300平米 占地面积约3300平米 2700平米的实验区 平米的实验区: 平米的实验区临床生化诊断试剂研发平台 免疫诊断试剂研发平台 分子诊断试剂研发平台 免疫组化诊断试剂研发平台 平米GMP标准的生产车间 约300平米 平米 标准的生产车间

总投资6500万元 万元 总投资

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泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发 与生产公共服务平台

荧光定量PCR仪 仪 荧光定量

凝胶成像仪

芯片点样仪

分子生物学平台芯片杂交仪 焦磷酸DNA测序仪 测序仪 焦磷酸

芯片扫描仪 超速离心机6

全自动核酸 提取仪

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康为世纪生物科技有限公司我们的客户 我们的合作伙伴

北京大学、清华大学、 北京大学、清华大学、完善的产品线 一站式服务平台

实验设计平台 分子生物学 全系列产品 蛋白质学产品 免疫学相关产品 分子生物学平台 蛋白表达与纯化 平台 抗体制备纯化平台 免疫学检测平台7

复旦大学等 中国科学院协和医院、 中国科学院协和医院、 上海瑞金、 上海瑞金、军事医学 科学院 301医院、医院 医院、 医院 华大基因、 华大基因、诺华制药 九强、 九强、博奥等

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a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB State Key Laboratory of Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China CCR4-NOT Deadenylates mRNA Associated with RNA-Induced Silencing Complexes in Human Cells State Key Laboratory of Molecular Biology and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Scienc

es, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China Coadministration of huperzine A and ligustrazine phosphate effectively reverses scopolamine-induce damnesia in rats School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PRChina Effects of Microgravity Modeled by Large Gradient High Magnetic Field on the Osteogenic Initiation of Human Mesenchymal Stem Cells CCR4-NOT deadenylates RISC-associated mRNA in human cells State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science shanghai,china

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主要内容1 2

Real-time qPCR的基本概念 的基本概念 Real-time qPCR的定量原理 的定量原理 Real-time qPCR的检测方法 的检测方法 Real-time qPCR的解析方法 的解析方法

3

4

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PCR: PCR:基本原理Denaturation: 94 – 96°C °基本要素： 基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T

Annealing: 50 – 65°C °

Extension: 70 – 75°C °

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PCR: PCR:基本原理S形曲线，具有平台效应 形曲线， 形曲线

理想的 理想的PCR反应： 反应： 理想的 反应 N=N0*2n 实际的 实际的PCR反应： 反应： 实际的 反应 N=N0* (1+E)n N0:初始模板量 N:第n次循环后的产物量 ： 次循环后的产物量 n:扩增反应的循环次数 ： E:扩增效率 ：

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与普通PCR的对比 与普通PCR的对比 PCR传统PCR检测 检测 传统 同一个样本进行96次重复 同一个样本进行96次重复 96 传统PCR检测 检测 传统

Real time PCR 检测

传统PCR--终点检测： 传统PCR--终点检测： PCR--终点检测

PCR--起点检测： --起点检测 Real time PCR--起点检测：

-- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 起点量是样本中起始的DNA量 终点产物量经过PCR放大的DNA量 起点量是样本中起始的DNA量 PCR放大的DNA DNA 生成了500 个拷贝” 加入了500个拷贝” -- “生成了500,0000,0000个拷贝” -- “加入了500个拷贝” 生成了500,0000,0000个拷贝 加入了500个拷贝 不恒定， 具有重现性， -- 不恒定，误差大 -- 具有重现性，误差小Company name

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Real-time qPCR

荧光基团 激发光 发射光

PCR反应体系中加入荧光基团 反应体系中加入荧光基团。 -- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。

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扩增曲线( 扩增曲线(primary curve) )线性图 对数图

扩增曲线： 扩增曲线：随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。 PCR反应的

进行 每经过一个循环，收集一次荧光信号， 每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩 增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn(荧光值) 横坐标：cycle number(循环数)Company name

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荧光阈值( 荧光阈值(threshold) )

基线(baseline):一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 基线(baseline):一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 (baseline) PCR反应前15 荧光阀值(threshold): 荧光阀值(threshold):扩增曲线上人为设定的一个值 (threshold) 缺省设置：PCR反应前 15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 反应前3 个循环荧光本底信号标准偏差的10 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 手动设置： -- 手动设置：大于样本的荧光背景值Company name

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Ct 值(Cycle Threshold)

Ct值 PCR扩增过程中 扩增过程中， Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。 设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。 PCR循环次数

起始模板量 基线

阈值

Ct值 Ct值Company name

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Ct 值(Cycle Threshold)

Ct值的特点： Ct值的特点： 值的特点 相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 96次扩增 DNA 很大， Ct值相对固定 值相对固定； 很大，但Ct值相对固定； Ct值则极具重现性 Ct值则极具重现性Company name

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Ct值可以确定初始模板量？ Ct值可以确定初始模板量？ 值可以确定初始模板量第n个循环的总信号 起始DNA DNA数目 PCR扩增效率 =本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度 当循环次数n=Ct时 当循环次数n=Ct时 n=Ct RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS

两边同时取对数得: 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)

Ct=Ct=-klgX0+bCt值呈线性关系 lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小 值越小。 起始拷贝数越多，Ct值越小。Company name

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标准曲线 (standard curve)106

105 104 103 102

未知

.LogDNA vs. Ct -- 标准曲线

10

number-Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线

标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释

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标准曲线分析 标准曲线分析

测定荧光定量PCR PCR反应的有效性 y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性 线性的标准曲线：相关系数R -- 线性的标准曲线：相关系数R2 扩增效率： -- 扩增效率： 扩增效率(E)=10 1/斜率 扩增

效率(E)=10-1/斜率-1

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荧光定量PCR检测方法 荧光定量PCR检测方法 PCR染料标记： 染料标记： SYBR Green Super green 探针标记： 探针标记： 水解探针： 水解探针： TaqMan 非水解探针： 非水解探针：Molecular beacon

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