蛋白质分离纯化基础技术培训20140429

蛋白分离纯化基础知识

概 述 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成 和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂 的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的 含量极低。 要把蛋白质从复杂的体系中分离出来， 同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧 失，显然是有相当难度的。

原材料的获取

破碎 研磨 超声 渗透压

蛋白溶解 酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……

粗提 沉淀 相分离 分子筛 ……

精提 各种色谱 电泳分离 差速离心 ……

保存 浓缩

保存状态保存条件 保存期限

酶……

……

培训内容 蛋白质样品的预处理 蛋白质常规层析技术 FDA关于蛋白质产品的重要规定

培训内容 蛋白质样品的预处理 蛋白质常规层析技术 FDA关于蛋白质产品的重要规定

预处理 液体材料– 过滤 – 离心

固体材料– 洗涤 – 材料破碎

破碎方法 机械破碎搅拌、振动 研磨 压滤 超声

非机械破碎干燥渗透压 冻融

酶

匀浆

超声破碎频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。

缺点：发热，剪切力强，体系中会产生自由基，它可能破坏蛋白 的结构。

渗透压破碎 渗透冲击法破碎 E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因 不要使用超声破碎法。 不破坏细胞壁，改变细胞膜的通透性。 0°C ,20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含2.5mMEDTA,高 渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT 至2mM左右； 均浆液组成原则：离子强度尽量低：≤50mM,有时需DTT, 不一定加EDTA,可考虑加PMSF,但此时不宜用Tris等胺类 缓冲剂

离心 离心是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的 混合物中各组分的方法。 是根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的 不同，而使物质分离的技术。

不同细胞结构分离所需的离心力结构 细胞核 线粒体 叶绿体 溶菌酶 微体 粗面内质网 质膜和光面内质网 cytosolic 离心力 g 800-1000 20,000-30,000 20,000-30,000 20,000-30,000 20,000-30,000 50,000-80,000 80,000-100,000 >100,000

游离核糖体、病毒粒体

150,000-300,000

离心方法 差速离心、 等密度梯度离心、 速率区带密度梯度离心 平衡等密度梯度离心 区带离心 连续流离心 。。。

离心 优点– 操作简单，成本较低

缺点– 沉淀的蛋白因为挤压、变性、聚集而失活 – 不适合大规模操作

超滤

分子量cutoff的含义如膜对被截留物质的截留率大于90%时，就用被截 留物质的分子量表示膜的截留性能，称为膜的截留 分子量。

超滤 超滤由于剪切力和发热的影响，易造成蛋白失活。

如果用超滤分离蛋白，只有分子量相差一个数量

级才可以分开 在蛋白浓度低的情况下，超滤膜对蛋白的吸附比

较强。可以用Tween20先钝化，能降低蛋白吸附

双水相抽提双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相

容性而形成有明显界面的两相系统

葡聚糖( Dextran ) 与聚乙二醇( PEG ) 按一定比例与水混合， 溶液混浊，静置平衡 后，分成互不相溶的 两相，上相富含 PEG 、 下相富含葡聚糖

各种类型的双水相体系类 型 形成上相的聚合物聚乙二醇

形成下相的聚合物葡聚糖

非离子型聚合物/ 非离子型聚合 物聚丙二醇

聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮

高分子电解质/非离子型聚合物 高分子电解质/高分子电解质 聚合物/ 低分子量化合物

羧甲基纤维素钠 葡聚糖硫酸钠 葡聚糖

聚乙二醇 羧甲基纤维素钠 丙醇 磷酸钾

聚合物/ 无机盐

聚乙二醇 硫酸铵

特点：两相均含有大量的水(高达80%以上), 界面张力小，一般只有0.5-10-4mN/m, 萃取环境和条件温和，

生物相容性好，有时有稳定作用；分配系数可控：聚合物修饰、相系统组成 操作条件容易放大几百倍。

选择双水相的原则 能够获得高的产物回收和生物活性回收，高的分离纯 化倍数； 系统的物理化学性质有利于大规模的应用，有良好的 工艺性能，系统黏度低，相分离快，达到相平衡时间 短，工艺参数容易控制，工艺条件可调性范围大；

系统经济，成本低，无毒，适合大规模应用。