微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色

细菌的染色

一、 实验目的

1、掌握细菌涂片标本的制备方法

2、掌握细菌革兰染色发和抗酸染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰氏染色结果

3、巩固显微镜油镜的使用和保护法 4、学习无菌操作技术

二、实验仪器和试剂

仪器：显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯

试剂：结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液、枯草芽孢杆菌、金黄色

葡萄球菌、大肠杆菌液体培养液、牙垢、石炭酸复红、3％盐酸酒精、碱性美蓝染液、枯草芽孢杆菌、擦镜液

三、实验原理：

革兰染色法：

萋－纳氏抗酸染色法：

枯草芽孢杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，它包围在肽聚糖的外

面，所以枯草芽孢杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。

萋－纳氏抗酸染色法是在加热条件下使枯草芽孢杆菌与石炭酸复

红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美蓝复

染后，枯草芽孢杆菌芽孢仍然为红色，而细菌为蓝色。

四、 实验步骤： 革兰染色： 1、涂片

左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧，冷却后从试管中取

菌液一滴,在洁净载玻片一端做一涂膜；

取一牙签在牙齿上轻轻划动取少量牙垢，在该洁净载玻片的另一端做一涂膜。 2、干燥

在空气中自然干燥。

3、固定

用镊子夹住涂片一端，将两涂膜出分别在火焰上连续通过三次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜。 4、染色

结紫初染：滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上，染色1分钟，水洗；

卢戈氏碘液媒染：用卢戈氏碘液覆盖涂片1分钟，水洗；

95%的乙醇脱色：滴加95%的乙醇，轻轻摇动玻片进行脱色，直

至流出的乙醇无紫色时，水洗；

蕃红复染：滴加蕃红染液复染2分钟以上，水洗，吸干镜检。 5、镜检

载玻片上滴加一滴香柏油，放油镜下镜检;注意标本中细菌的形态、大小，排列和颜色。

萋－纳氏抗酸染色法： 1、涂片、固定

用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。 2、染色

滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住涂片微火加热，保持染

液冒蒸汽约5分钟，切勿蒸发至干或使染液沸腾； 冷后，水冲洗；

以3％盐酸酒精脱色，至片上红色全部脱去为止；

水冲洗后，以碱性美蓝液复染1分钟，水洗，待干，镜检。

五、注意事项：

1、载玻片是否干净，取菌量、合适的菌龄、热固定及每一步水洗和酒精脱

色程度是实验成功的关键；

2、禁止把染液倒入水池中，回收到废液桶中。

六、讨论：

1、记录革兰氏染色结果，并描述形状，菌体排列和颜色，看看与理论上是

否相同；如不同，分析原因；

2、分析影响革兰氏染色结果的因素；

3、牙垢里大概能看到几类菌，哪几种较多？

七、实验结果： 1、革兰染色结果： 理论结果：

染色结果：

革兰氏阳性菌呈紫色; 革兰氏阴性菌呈红色;

实际结果：

金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果呈紫色，为革兰氏阳性菌；大肠杆菌革兰氏染色结果呈红色，为革兰氏阴性菌。

片中多数杆状菌体，分散排列，紫色较为明显，红色较为微弱。与理论较为一致。

2、影响革兰氏染色结果的因素：

菌龄：取处于对数生长期的细菌，此时结果典型。 操作：

热固定：温度不能太高，否则会造成细菌结构的破坏。 染色：染料应过量，避免结晶。初染和媒染：时间在30-60s

为宜。

复染：时间可稍长。

脱色：约30s，以流下的脱色液无色为准，否则制片上会留

有杂质或造成假阳性或假阴性。

水洗：要充分，否则制片上会留有杂质。

3、此为显微镜下牙垢中细菌的革兰染色图。图中紫色较为明显，可见所取

牙垢中细菌多为革兰氏阳性菌。 操作上可能存在问题，涂片并不是十分清晰，依稀可见球菌和杆菌，有分散排列的，也有聚集排列的。

4、萋－纳氏抗酸染色结果：

理论上枯草芽孢杆菌芽孢应呈红色，而菌体则呈蓝色。但是涂片上有明显可见的蓝色，却未找到清晰的红色。

分析可能的原因：在接种环上没有蘸取到足够的芽孢菌体；热固定时破坏了样品；水洗和脱色不完全；在用石炭酸复红染色时未能及时添加试剂，使得实验结果出现偏差。

理论枯草芽孢杆菌：