脐血干细胞的分离方法比较

stem cell

华西医学2007,22(2)　CN51-1356/R

[文章编号]1002-0179(2007)02-0345-03

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脐血干细胞的分离方法比较

MethodsofSeparatingStemCellsfromUmbilicalCordBlood

黄韬,李波3,林浩铭

HUANGTao,LIBo,LINHao-ming

(四川大学华西医院普外二科,四川成都　610041)

(DepartmentofGeneralSurgery,WestChinaHospital,SichuanUniversity,China610041,China)

　　摘要:目的:为合理选择脐血干细胞的分离方法提供参考。方法:采用改良HES(羟乙基淀粉)沉降分离法

和Ficoll分离法分离脐血干细胞,比较两种方法分离前后的有核细胞数、分离后的CD34+细胞数、分离后的有核细胞回收率及台盼蓝拒染率。结果:改良HES沉降分离法和Ficoll分离法分离前的脐血量、有核细胞浓度和细胞数差异无统计学意义(P>0105);分离后改良HES法有核细胞数、CD34+细胞数Ficoll分离法(P<0105),105)。结论:改良HES分离法的有核细胞回收率高,分离速度快、污染机会小、,。

关键词:脐血;有核细胞;干细胞;分离[中图分类号]R457　　　[A　　Abstract:oanseparatingstemcellsfromumbilicalcordblood1Methods:Umbili2calcordbloodbloodbagsandwereseparatedbyusinghydroxyethylstarch(HES)andFicollmethod1Nuclear,D34+cellsandtrypanbluedyeviabilitywerecomparedbetweenHESandFicollmethod1Results:Therewasnodifferenceinthevolumeofumbilicalcordblood,thedensityandthenumberofthenuclearcellsbetweenHESandFicollmethodbeforeseparating(P>0105)1Butafterseparating,thenumberofnuclearcellsandCD34+cells,therateofrecollec2tionforthenuclearcells(thepercentageofthenumberofnuclearcellsofpost-separationandpre-separation)byusingHESseparatingwerehigherthanthatofusingFicollseparating(P<0105)1TherewasnodifferenceintherateofrefusingtrypanbluedyebetweenHESandFicollseparating(P>0105)1Conclusions:Thequantityofhumancordblood-derivedstemcellscollect2edbyusingimprovedHESseparationishigh,theoperationissimpleandconvenient,thespeedofseparatingisquick,theoppor2tunityofpollutionissmallandfinalvolumeissmall,whichisabettermethodofseparatingstemcellsfromumbilicalcordblood1

Keywords:umbilicalcordblood;nuclearcells;StemCells;separation

(Receiveddate:2006-12-21)

　　脐血富含造血干细胞,来源丰富,已成为继骨髓和外周血之后又一重要的造血干细胞来源。研究认为,造血干细胞移植可治疗恶性血液病,如白血病、淋巴瘤和再生障碍性贫血,因此寻找一种有效的脐血造血干细胞分离法,为临床提供适合移植的脐血十分重要,为此,我们对两种脐血造血干细胞分离方法进行了比较。

表11分离前HES组与Ficoll组脐血基本情况

分组

HES组Ficoll组

n55

脐血体积

( x±S,ml)88180±2118086100±181603

细胞浓度

( x±S,×108/dl)

13170±018014112±01903

3

有核细胞数

(x ±S,×108)

12108±216412136±31253

33

与HES组比较:3t=01218,P=01833;33t=-01782,P=01457;333t=-01145,P=01888

表21两种方法脐血分离后主要指标测定比较( x±S)

分组

HES组Ficoll组

n55

1　材料与方法

111　主要试剂及其配制

6%羟乙基淀粉(60g/L):美国Sigma公司产品。

氯化铵破红细胞液(NH4CL):01155MNHCL4、011011MKHCO3、

()0110mMEDTA乙二胺四乙酸。

磷酸缓冲盐溶液(PBS):8gNaCl、012gKCl、012gKH2P04、1115gNa2HP0417H2O溶于800m1双蒸水,用浓盐酸将pH值调整至712,定容至1000m1,15磅15min高压灭菌。

白细胞稀释液:冰醋酸210ml,亚甲蓝(10g/L)3滴,双蒸水定容至120ml。015%台盼蓝染液:台盼蓝015g,生理盐水100m1。

RPMI1640液:美国Gibco公司产　3通讯作者　作者简介:黄韬(1968-),男,四川省西充县人,主治医师,主要从事肝脏外科的临床研究工作,现在四川省第五人民医院普外科。

有核细胞数(×108)

10130±21246177±0174

3

回收率

(%)85148±318056192±11114

33

分离后CD34+

(×106)

3153±01342112±0132

33

333

台盼蓝拒染率

(%)9812±11489710±11583

333333

与HES组比较:3t=31351,P=01010;33t=51427,P=01001;3

=11238,P=01251

t=61811,P=01000;3

t

品。

淋巴细胞分离液(Ficoll液):上海试剂二厂。

鼠抗人CD34-PE单克隆抗体和CD45-CY5单克隆抗体:Pharmingen公司产品。112　脐血的采集

在四川大学华西第二医院产科选择排除了HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染、无血液系统疾患及其他系统疾病的非高危妊娠健康足月产妇,新生儿为经阴道顺产且生后皮肤红润,四肢活动良好,无感染征象的脐血。待新生儿娩出后,立即在距脐轮5～7cm处钳夹结扎脐带并切断。消毒脐带侧,行脐静脉穿刺。脐带(胎盘)血借宫缩力流入采血袋内(袋内预先含有无菌抗凝剂),摇动均匀,直至无脐血流出为止。113　脐血分离的方法

将10份脐血采用随机数字表的方法分成两组,每组5份标本。一组采用改良HES法分离有核细胞(HES组),另一组采用Ficoll法分离(Ficoll组)。11311　改良HES分离法

改良HES分离法即在传统HES法分离的后期给予氯化铵破红细胞液减少分离体积。具体步骤如下:

(1)在超净工作台上、在无菌条件下,消毒穿刺部位,将6%羟乙基淀粉(HES)分别加入每份采血袋内(HES的加入量为血量的1/4),混匀,无菌封口胶密封穿刺点,在10℃低温环境中倒置6小时分层。

stem cell

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WESTCHINAMEDICALJOURNAL2007,Vo1122,No12　CN51-1356/R

(2)缓慢放出袋内脐血的下层红细

胞,置于50ml离心管中,上层血浆放入另一50ml离心管内。

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