7第3章基因工程第9、10节

生物技术制药36讲

第九节 基因工程药物的 质量控制是利用活细胞作为表达系统，产 是利用活细胞作为表达系统， 物的分子量较大， 物的分子量较大，并有复杂的结 还参与生理功能的调节， 构，还参与生理功能的调节，用 量极微， 量极微，任何质和量的偏差都可 贻误病情造成严重危害。 贻误病情造成严重危害。

生物技术制药36讲

宿主细胞中表达的外源基因， 宿主细胞中表达的外源基因， 在转录翻译精制工艺放大过程 中都可能发生变化， 中都可能发生变化，故从原料 以及制备全过程都必须严格控 制条件和鉴定质量。 制条件和鉴定质量。

生物技术制药36讲

一、 原材料的质量控制原材料的质量控制是确保编码 药品的DNA序列的正确性 序列的正确性， 药品的DNA序列的正确性，重组微 生物来自单一克隆，所用质粒纯而 生物来自单一克隆， 稳定， 稳定，以保证产品质量的安全性和 一致性。 一致性。

生物技术制药36讲

根据质量控制要求应了解以下 特性： 特性： 明确目的基因的来源、克隆经过， ⒈明确目的基因的来源、克隆经过， 并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证； 和核苷酸序列予以确证；

生物技术制药36讲

⒉应提供表达载体的名称、结构、遗 应提供表达载体的名称、结构、 传特性及各组成部分(如复制子、 传特性及各组成部分(如复制子、 启动子)的来源与功能， 启动子)的来源与功能，构建中所 用位点的酶切图谱， 用位点的酶切图谱，抗生素抗性标 记物； 记物； 应提供宿主细胞的名称、来源、 ⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、 传代历史、 传代历史、检定结果及其生物学特 性；

生物技术制药36讲

⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法 及载体在宿主细胞与载体结合后的 遗传稳定性； 遗传稳定性； ⒌提供插入基因与表达载体两侧端 控制区内的核苷酸序列，详细叙述 控制区内的核苷酸序列， 在生产过程中启动与控制基因在宿 主细胞中表达的方法及水平等。 主细胞中表达的方法及水平等。

生物技术制药36讲

二、培养过程的质量控制在工程菌的贮存中， 在工程菌的贮存中，要求种子 克隆纯而稳定； 克隆纯而稳定； 在培养过程中， 在培养过程中，要求工程菌所 含的质粒稳定，始终无突变； 含的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中， 在重复生产发酵中，工程菌表 达稳定； 达稳定； 始终能排除外源微生物污染。 始终能排除外源微生物污染。

生物技术制药36讲

生产基因工程产品应有种子 批系统， 批系统，并证明种子批不含有致 癌因子，无细菌、病毒、 癌因子，无细菌、病毒、真菌和 支原体等污染， 支原体等污染，并由原始种子批 建立生产用工作细胞库。 建立生产用工作细胞库。

生物技术制药36讲

原始种子批须确证克隆基因 DNA序列

详细叙述种子批来源、 序列， DNA序列，详细叙述种子批来源、 方式、保存及预计使用期， 方式、保存及预计使用期，保存 与复苏时宿主载体表达系统的稳 定性。 定性。

生物技术制药36讲

对生产种子，应详细叙述细 对生产种子， 胞生长与产品生成的方法和材料， 胞生长与产品生成的方法和材料， 并控制微生物污染； 并控制微生物污染；提供培养生 产浓度与产量恒定性数据， 产浓度与产量恒定性数据，依据 宿主细胞-载体系统稳定性， 宿主细胞-载体系统稳定性，确定 最高允许传种代数； 最高允许传种代数；

生物技术制药36讲

在培养过程中，应测定被表 在培养过程中， 达基因分子的完整性及宿主细 胞长期培养后的基因型特征； 胞长期培养后的基因型特征； 依宿主细胞依宿主细胞-载体稳定性与产品 恒定性，规定持续培养时间， 恒定性，规定持续培养时间， 并定期评价细胞系统和产品。 并定期评价细胞系统和产品。

生物技术制药36讲

培养周期结束时，应监测 培养周期结束时， 宿主细胞-载体系统的特性， 宿主细胞-载体系统的特性， 如质粒拷贝数、 如质粒拷贝数、宿主细胞中表 达载体存留程度， 达载体存留程度，含插入基因 载体的酶切图谱等。 载体的酶切图谱等。

生物技术制药36讲

三、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生 物学试验数据，确证提纯物分 物学试验数据， 子批间保持一致性； 子批间保持一致性；外源蛋白 DNA与热源质控制在规定 质、DNA与热源质控制在规定 限度以下。 限度以下。

生物技术制药36讲

在精制过程中能清除宿主 细胞蛋白质、核酸、糖类、 细胞蛋白质、核酸、糖类、病 毒、培养基成分及精制工序本 身引入的化学物质， 身引入的化学物质，并有检测 方法。 方法。

生物技术制药36讲

四、目标产品的质量控制基因工程药物的质量控制主要 包括以下几项要求:产品的鉴别、 包括以下几项要求:产品的鉴别、纯 活性、安全性、 度、活性、安全性、稳定性和一致 它需要利用生物化学、免疫学、 性。它需要利用生物化学、免疫学、 微生物学、 微生物学、细胞生物学和分子生物 学等多学科的理论与技术所建立的 鉴定方法。 鉴定方法。

生物技术制药36讲

⒈产品的鉴别常用的鉴定方法: 常用的鉴定方法: 电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、 电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、 免疫电泳 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、酶联 免疫(ELISA) 免疫(ELISA) 受体结合试验 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、 圆二色谱、 末端序列分 析、圆二色谱、核磁 共振

生物技术制药36讲

⑴ 肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解 目的蛋白质, 目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分 析。它是检测蛋白

质一级结构最有效 的方法， 的方法，该技术灵敏高效是对基因工 程药物的分子结构和遗传稳定性进行 评价和验证的首选方法。常用HPLC、 评价和验证的首选方法。常用HPLC、 毛细管电泳。 毛细管电泳。

生物技术制药36讲

⑵ 氨基酸成分分析 50个氨基酸较理想 50个氨基酸较理想 ⑶ 部分氨基酸序列分析 N端15个氨基酸可作为重 15个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。 定指标。

生物技术制药36讲

⑷ 重组蛋白质浓度测定和相对分 子量的测定 蛋白质浓度测定方法有:福林蛋白质浓度测定方法有:福林-酚 法、双缩脲法 蛋白相对分子量的测定: 蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤 SD-SPAGE法 法、SD-SPAGE法