全长cDNA文库的构建方法(2)

关于cDNA文库构建的方法原理流程及试剂盒等

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ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２２Ｎｏ．２２００６Ｆｅｂｒｕａｒｙ

ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ

能分析的进程；尤其是对基因组庞大，近期内不能进行全基因组测序的生物体来说，更是进行基因组研究的一条重要途径。

然而目前，全长ｃＤＮＡ文库构建方法还是个比较新的研究领域，已报道的构建方法有Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ法［１］、ＣＡＰｔｕｒｅ法［２］、ＳＭＡＲＴ法［３］、ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ法［４］、Ｃａｐ－Ｓｅｌｅｃｔ法［５］和ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ［６］法。这些方法在构建文库原理、所建文库的全长率及代表性和实际应用等方面都存在着明显的差异。

１Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ方法

Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ法是ＳｕｍｉｏＳｕｇａｎｏ实验室于１９９４年开发的［１］，该法利用一个寡聚核苷酸链替换ｍＲＮＡ的帽子结构，达到标记ｍＲＮＡ５’端的目的。首先，以ｍＲＮＡ为起始材料，利用细菌碱性磷酸酶（ＢＡＰ）水解５’端不完整ｍＲＮＡ上的５’磷酸基团，防止截短的ｍＲＮＡ与寡聚核苷酸链连接；再用烟草酸焦磷酸酶（ＴＡＰ）除去ｍＲＮＡ５’端的帽子结构，在原ｍＲＮＡ的５’端帽子处只留下一个磷酸基团；通过用Ｔ４ＲＮＡ连接酶在ｍＲＮＡ的５’端连上一个寡聚核糖核酸，作为引发二链合成的引物，再经过反转录，ＰＣＲ扩增，这样只有完整的ｍＲＮＡ才能够被合成ｃＤＮＡ，即全长ｃＤ－ＮＡ。

该方法的不足之处在于：（１）需要多种酶参与反应，酶的效率直接影响文库的最终质量，尤其是Ｔ４ＲＮＡ连接酶的连接效率非常低，文库构建的反应效率比理论值低，因此构建文库对各种酶质量要求很高。（２）ｍＲＮＡ经多步酶处理，易产生降解，需要大量的起始材料。（３）各种酶对底物有一定的倾向性、ＰＣＲ反应对模板量和长度有一定的选择性，导致文库中某种类型克隆富集，冗余程度强；某种类型克隆丢失，文库缺失代表性，不能真实反映组织中各基因的存在情况。（４）烟草酸焦磷酸酶非常昂贵，实验所需成本较高［７］。

Ｊｕｎｇ－Ｈｗａ等（２００３）对这种方法做了一些改进［８］：即先以少量总ＲＮＡ（约１００μｇ）而不是ｍＲＮＡ为起始材料，寡聚核糖核酸替代帽子反应后再分离ｍＲＮＡ，进行ｃＤＮＡ合成。改进后的方法以总ＲＮＡ做为ｍＲ－ＮＡ的载体，防止酶处理过程中ｍＲＮＡ降解，起到保护ｍＲＮＡ的作用。因此其在建库效率、全长比例、代表性方面都稍好于原方法［９］，另外所用起始材料相对减少。

２ＣＡＰｔｕｒｅ方法

该方法始于１９９５年［２］，它通过亲和蛋白对帽子的亲和以及ＲｎａｓｅＡ对单链ＲＮＡ的切割来富集全长ｃＤＮＡ。Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白对ｍＲＮＡ甲基化的帽子具有强的特异绑定能力［１０］，能将有甲基化帽子和无甲基

化帽子的两种ｍＲＮＡ分开。被绑定的ｍＲＮＡ反转录

形成ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ杂合体，经过ＲｎａｓｅＡ和Ｔ１的联合作用，降解未被ｃＤＮＡ保护的单链ｍＲＮＡ，最后，只有具有甲基化帽子的完整ｍＲＮＡ与其相应的全长ｃＤ－ＮＡ被绑定到Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白上，经纯化、富集后建库。该方法亲和性蛋白的选择性强，酶促反应较少，降低了ｍＲＮＡ降解的风险，从而使文库的全长比例较高。该方法由于不进行ＰＣＲ反应，基因的冗余性降低。

这种方法具有明显的缺点：（１）Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白对甲基化帽子的绑定能力强，而对非甲基化的帽子几乎无绑定能力，从而导致了５’端帽子非甲基化的完整ｍＲＮＡ信息丢失。（２）亲和蛋白与帽子结合时，ｍＲ－ＮＡ５’端会有１０￣５０ｂｐ丢失，严格地讲，该方法所构建的文库并非全长文库，不利于分析。（３）所需起始材料用量大，约为１００μｇｍＲＮＡ，不适于有限材料建库。（４）Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白的获取、纯化过程非常复杂，成本相对很高［７］。因此，该方法目前只能作为理论上的一种研究，很难在全长文库构建的实践中得到应用［１１］。３ＳＭＡＲＴ方法

ＳＭＡＲＴ方法是Ｃｈｅｎｃｈｉｋ等１９９６年提出的［３］，该方法利用ＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶ｓｆｉⅠ的特性，快速、简单地构建全长ｃＤＮＡ文库。

ＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ反转录酶是Ｍ－ＭＬＶＲ（Ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ａｓｅ）点突变而来的，丧失了ＲｎａｓｅＨ的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别ｍＲ－ＮＡ５’帽子结构，在相应的核酸３’端以ｏｌｉｇｏ（ｄＧ）寡聚核苷酸链为延伸模板互补上一段ｏｌｉｇｏ（ｄＣ）寡聚核苷酸序列。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。随着体系的优化，在一链合成的缓冲液中加了ＭｎＣｌ２，有的还含有ＢＳＡ，从而明显地提高了延伸效率［１２］。

用于反转录的５’端ｐｏｌｙ（Ａ）引物和延伸模板分别含有ｓｆｉＩ（Ａ）、ｓｆｉＩ（Ｂ）识别位点的寡聚核苷酸序列，以此为依据设计一对引物，ＬＤ－ＰＣＲ特异合成全长二链并扩增。而截短的一链ｃＤＮＡ，反转录酶没有识别到ｍＲＮＡ５’帽子结构，一链ｃＤＮＡ３／端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有ｓｆｉＩ识别位点的全长ｃＤＮＡ，经两种类型（Ａ、Ｂ）内切酶ｓｆｉＩ酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长ｃＤＮＡ内部由于ｓｆｉＩ识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。

与其他方法相比，此方法有其独特的优点：（１）所需起始材料少，一般０．５￣１μｇｍＲＮＡ（。２）ｍＲＮＡ在合