全长cDNA文库的构建方法(3)

关于cDNA文库构建的方法原理流程及试剂盒等

中国农学通报第２２卷第２期２００６年２月

ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ

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成ｃＤＮＡ前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中ｍＲＮＡ的降解和损耗。（３）实验过程快速、简单，整个过程没有对ｍＲＮＡ和中间产物的复杂处理。（４）全长比例较高［１３］。

ＳＭＡＲＴ方法也有其自身明显的缺点：（１）ＰＣＲ扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于３ｋｂ片段和低峰度全长基因［１３］，同时也造成了文库冗余性强；（２）ｄＧ加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐［１４￣１７］，尤其是在医学领域中应用较广［１８￣２０］。在广泛的应用中，该方法的研究者和应用者又对其某些方面进行了技术改进，提高了该方法的应用价值。

ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｔｅｃｈｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍｅｅｔｉｎｇｓ／ｂｉｔｓ２０００／ａｂｓｔｒａｃｔｓ／ｗｅｌｌｅ－

。需要注意的一点是：这种方法是对全ｎｒｅｕｔｈｅｒ．ｓｈｔｍ）

长反转录产物的选择而不是对完整ｍＲＮＡ的选择，因

此，为了得到大片段的全长克隆，需制备高质量的ｍＲＮＡ。

４ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ方法

ＣＡＰ－Ｔｒａｐｐｅｒ方法是由Ｃａｒｎｉｎｃｉ等提出的［４］，它是根据ｍＲＮＡ５’端及３’端存在一个共同二醇结构来建库。将这种二醇结构氧化后进行生物素修饰，再经过沉淀、酒精洗涤、无ＲＮａｓｅ的双蒸水重新悬浮等筛选步骤，得到生物素化的ｍＲＮＡ，经反转录酶催化合成ｃＤ－ＮＡ第一链，接着进行ＲＮａｓｅＩ处理，未被ｃＤＮＡ保护的ｍＲＮＡ（包括非全长ｃＤＮＡ与ＲＮＡ杂交体中暴露的ｍＲＮＡ５’端及所有的未被ｃＤＮＡ保护的ｍＲＮＡ）被

３．１Ｌｉｔｔｌｅ－ｃｙｃｌｅＳＭＡＲＴ

这种改进采用终端对终端的ＰＣＲ扩增，将循环数降解。后经青链霉素磁珠吸附并使用弱碱降解ｍＲ－由１８减少到３，这样就大大减小了ＰＣＲ扩增对长片ＮＡ，得到单链全长ｃＤＮＡ，在末端转移酶的催化下进段的不利影响，提高了长片段全长基因克隆的可能性，行５’端Ｏｌｉｇｏ（Ｇ）加尾，再进行第二链的合成，定向克提高了文库的代表性；而且，也明显降低了ＰＣＲ扩增隆即可得到全长ｃＤＮＡ文库。所产生的基因错配和文库的冗余程度［２１］。为了提高合成全长ｃＤＮＡ的能力和测序效果，该

方法进行了改进。一是用海藻糖、山梨糖醇热启动反转３．２ＳｕｐｅｒＳＭＡＲＴ

录反应。ｍＲＮＡ５’端二级结构阻碍反转录的进行，高这种方法以原有“ＳＭＡＲＴ”技术为基础，将起始

材料减少到１０￣１００个细胞，大概只需５０ｎｇ总ＲＮＡ，温破坏二级结构但同时也抑制反转录酶活性。海藻糖

的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保证反转录酶的使得该技术非常适合那些材料相当少的实验。另外可

活性在５５￣６０℃的高温下正常发挥［２３，２４］，有利于全长用受基因组ＤＮＡ污染的起始材料建库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．

ｃＤＮＡ的合成。二是用Ｓｓｔｈ或ＢｓａＩ、ＢａｍＨｌ＼Ｘｈｏｌ双酶ｏｚｙｍｅ．ｆｒ／＿ｐｒｏｄ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ｐｄｆ／ｓｍａｒｔ＿ｓｕｐｅｒｐｒｏｔｏ．ｐｄｆＢＤ

切替换ＥｃｏｌＩ＼Ｘｈｏｌ双酶切。ＥｃｏｌＩ对甲基化不敏感，容ＳｕｐｅｒＳＭＡＲＴＭｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）。

易将全长ｃＤＮＡ近端的内部已甲基化的识别位点切３．３Ｌａｒｇｅ－ｓｉｚｅＳＭＡＲＴ

割。用对甲基化敏感的限制性内切酶Ｓｓｔｈ或ＢｓａＩ、最近，ＲｕｔｈＷｅｌｌｅｎｒｅｕｔｈｅｒ等［２２］提出了一种获得长

ＢａｍＨｌ等替换ＥｃｏｌＩ，提高了文库全长比例。三是用序列的全长ｃＤＮＡ的方法，是针对ＳＭＡＲＴ很难获得

ＳＳＬＭ法加尾克服Ｏｌｉｇｏ（Ｇ）加尾对测序的干扰［２５］，虽大于３ｋｂ的全长ｃＤＮＡｓ这一局限而做的改进，即在

然加尾效率（４４％）稍抵于Ｏｌｉｇｏ（Ｇ）加尾（５２％），但该ＰＣＲ扩增合成双链ｃＤＮＡｓ前，先将一链产物按片段

且加尾时无须使用ＭｎＣｌ２和大小分出３￣４个等级，再分别ＰＣＲ扩增和克隆。这样，法加尾对片段无选择性，

ＣｏＣｌ２，不会造成全长ｃＤＮＡ降解，还利于全长ｃＤＮＡ就避免了ＰＣＲ扩增和载体连接对片段大小产生偏爱

性的缺点，使长片段的基因也能得到等效扩增和克隆。的转录和表达克隆［２６，２７］。

与其他方法相比，ＣＡＰ－Ｔｒａｐｐｅｒ方法可以说是一运用该方法构建的文库，不仅全长比例要比传统

种较好的构建高质量全长文库方法，它兼顾了文库代建库方法高的多［２１］，而且，大于３ｋｂ的插入片段中，全

表性好（９４％），全长比例高（７８％￣９０％），建库效率高长比例也比其它方法高［１３］。以往方法所构建的文库，即

的优点［１３，２８］。但也有些缺点：（１）使以λ噬菌体为载体也很少能得到大于７ｋｂ的全长（２．２×１０６ｐｌａｑｕｅｓ／９μｇ）

ｍＲＮＡ长期暴露在酶反应体系中，有降解风险；（２）各克隆，而该方法所构建的最大片段级的λ噬菌体亚文

反应难于控制，所需实验技术高；（３）实验流程长，过程库中，插入片段的平均长度可达到７ｋｂ，最长的可达到

复杂，耗时，费力。１０ｋｂ［２２］。由此可见，该方法明显地提高了文库的代表

５ＣａｐＳｅｌｅｃｔ方法性，为获得大片段全长克隆和低丰度克隆提供了可能

该方法是奥地利的Ｗｏｌｆｇａｎｇ于１９９９年提出的［５］，性。该技术可以用于构建目的基因所在片段范围的文

与ＳＭＡＲＴ有两点不同，一点是一链全长ｃＤＮＡ延伸库，提高获得全长目的基因的概率（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ．