全长cDNA文库的构建方法(4)

关于cDNA文库构建的方法原理流程及试剂盒等

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ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２２Ｎｏ．２２００６Ｆｅｂｒｕａｒｙ

ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ

机制不同。ＣａｐＳｅｌｅｃｔ是反转录酶催化合成到５’端时，识别帽子结构，在全长一链ｃＤＮＡ３’端延伸了３￣４个Ｇ。另一点不同就是该方法运用了ＣＲＴＣ技术［２９］，即ｃＤＮＡ末端可控加尾技术。通过优化末端转移酶的反应条件，在已加有３￣４个的全长一链ｃＤＮＡ末端以９３％的效率添加３￣４个Ａ，再通过优化的Ｔ４ＤＮＡ连接反应，将有突出端的双链接头与全长一链高效连接，根据接头和５’端Ｐｏｌｙ（Ｔ）特点设计引物，ＰＣＲ扩增后得到全长ｃＤＮＡ。

该方法延袭了ＳＭＡＲＴ的优点，同时对ＳＭＡＲＴ方法的ｄＧ加尾效率低，信息丢失的缺点加以改进，增加了全长ｃＤＮＡ选择强度，可靠性更高。缺点在于：（１）即使条件优化，也仅约有８２％的全长ｃＤＮＡ得到筛选（２）无法剔除ｃＤＮＡ混合样中的非全长ｃＤＮＡ。从实际应用上看，该方法与ＳＭＡＲＴ相比，建库效果无明显优越性，加之ＳＭＡＲＴ试剂盒的完善，相比之下，ＳＭＡＲＴ试剂盒更受欢迎。因此，该方法很少见报道［３０］。６ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ方法

该方法是Ｅｆｉｍｏｖ在２００１年报道的［６］，其基本原理为ｍＲＮＡ两端的二醇基团经高碘酸氧化为二醛基团，再与乙二铵的氨基结合，这样３’端经高碘酸氧化的寡聚核糖核酸（延伸模板）可化学连接到ｍＲＮＡ的５’端。５’端带有一段核糖核酸的ｍＲＮＡ作为反转录的模板合成一链ｃＤＮＡ，反转录酶在高浓度Ｍｎ２＋存在的条件下发挥了极强的末端转移酶活性，使一链ｃＤＮＡ的３’端加上３￣５个Ｇ，从而越过帽子结构，以寡聚核糖核酸为模板延伸。依据延伸模板和３’端Ｐｏｌｙ（Ｔ）设计引物，ＰＣＲ特异扩增合成全长二链ｃＤＮＡ。

该方法结合了ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ和ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ的特点，但也有区别之处。与ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ法相比较，二者都是在ｍＲＮＡ的５’端化学连接上了一段寡聚核糖核酸链，设计特异引物，ＰＣＲ扩增合成二链。不同之处在于，ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ方法是用一段寡聚核糖核酸链替换了帽子结构，帽子结构被去除；而该方法不去除帽子结构，直接在５’端化学连接上一段寡聚核糖核酸链。与ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ方法相比较，两者都用高碘酸钠氧化ｍＲ－ＮＡ两端的二醇基团为二醛基团；但ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ中的二醛基团被生物素的氨基替换，而该方法的二醛基团被乙二铵的氨基替换。还有值得一提的是，Ｅｆｉｍｏｖ提

［６］

出的改进方法“ｓｉｍｐｌｅｐｈａｓｅｐｒｉｃｅｄｕｒｅ”在生物素标记ｍＲＮＡ５’端的延伸摸板，磁珠筛选全长ｍＲＮＡ方面的原理都与ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ法相应部分相同。由于ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ在实践中还未展开应用，其明显的优缺点还不清楚，有待人们在进一步的研究与应用中发现和改正。

综上所述，ＳＭＡＲＴ方法和ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ方法的研究比较成熟，而且在实际应用中有其鲜明的优点，因此，这两种方法在全长ｃＤＮＡ文库构建中将会有广阔的应用前景。ＳＭＡＲＴ方法本身虽然具有冗余性高、插入片段短的缺点，但其改进技术Ｌｉｔｔｌｅ－ｃｙｃｌｅＳＭＡＲＴ和Ｌａｒｇｅ－ｓｉｚｅＳＭＡＲＴ一定程度上克服了这两个缺点。这两种改进技术已分别在人脑瘤组织［１９］和德国人群全长ｃＤＮＡ文库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｋｆｚ．ｄｅ／ｓｍｐ－ｃｅｌｌ／ｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｇｒｏｕｐｓ．ａｓｐ？ｓｉｔｅＩＤ＝７ＴｈｅＧｅｒｍａｎＨｕｍａｎｃＤＮＡｃｏｎｓｏｒ－ｔｉｕｍ）构建中得到了成功的应用，但目前还未见到将两种技术同时应用在全长ｃＤＮＡ文库构建上的报道。如果能做到这一点，相信ＳＭＡＲＴ方法在将来会成为一种简单、快速、高质量的全长ｃＤＮＡ文库构建方法。ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ方法虽然对试验技术要求高，过程复杂，但文库质量高，这对于有一定基础和规模的实验室来讲是大规模构建全长ｃＤＮＡ文库进行深入研究最有价值的方法。利用该方法美国人成功构建了老鼠全长ｃＤＮＡ文库［３１］，日本人也成功构建了拟难芥［２８］、水稻全长ｃＤＮＡ文库［３２］，文库全长比例都在９０％左右。从这些文库中，研究者们不仅获得了大量有价值的全长序列，对其功能基因组进行深入研究，而且对基因组结构进行了预测。可见，构建高质量的ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ文库会带来一劳永逸的效果。

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