应用于PCR技术的DNA聚合酶(2)

关于酶学

基酸序列,这些DNA聚合酶都已经广泛应用于PCR技术中。

2　早期应用于PCR技术的DNA聚合酶———Klenow片段

1957年A1Kornberg等从大肠杆菌中分离出了一种以DNA为模板催化单核苷酸聚合的酶,称之为Kornberg酶,它是由单一多肽组成的球蛋白,相对分子量为103000Kd。活性区域位于Leu516和His920之间,包括三种不同的酶活性,即5′-3′聚合酶活性、5′-3′外切酶活性和3′-5′外切酶活性。与其它种类的DNA聚合酶一样,其催化单核苷酸聚合的反应需要引物的存在,并且在37℃时聚合活性最高,催化单核苷酸聚合的速率为1000nt/min。Kornberg酶即为DNA聚合酶Ⅰ。

聚合酶Ⅰ可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶裂解成两个活性片段,较大的C端片段称为Klenow片段,它仍具有5′-3′聚合酶和3′-5′核酸外切酶活性,但失去了5′-3′核酸外切酶活性。较小的N端片段只有5′-3′核酸外切酶活性。Klenow片段就是早期应用于PCR的DNA聚合酶。但是KlenowDNA聚合酶的缺点是在37℃下催化DNA的合成,在60℃时很快就失活,故每一轮PCR都需要追加KlenowDNA聚合酶,使PCR过程繁琐而复杂,同时其亲核反应的掺错率也居高不下,正因为上述缺点而限制了该酶在PCR反应中的应用。其后人们也曾将T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶应用于PCR反应,但是终因它们的热稳定性差而没能得到推广应用[4]。

3　耐热TaqDNA聚合酶的发现和应用

Themusaquatics是一种热栖的可在70℃～95℃下生活的水生真细菌。1988年RandllK1Saiki等从Thermusaquatics中分离纯化到了TaqDNA聚合酶,并将其应用于PCR技术,取代了大肠杆菌Klenow片段,使PCR过程实现了自动连续循环。TaqDNA聚合酶基因全长2496bp,编码832个氨基酸,蛋白分子量为94Kd,以Mg2+作辅助因子,属于DNA聚合酶家族A,和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有非常高的同源性。其功能区域在287～832氨基酸之间,它是一种极端耐热的DNA聚合酶,在9215℃酶活性可持续130min,95℃可保持40min,9715℃5～6min仍可保持约50%酶活性。Taq酶是第一个被应用于PCR的高热稳定DNA聚合酶,也是活性最高的一种耐热DNA聚合酶,具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性,同时还存在非模板依赖性活性[18],但缺乏3′-5′外切酶活性,所以在DNA合成过程中对单核苷酸错配没有校正功能,每一循环错配率高达2×10-4核苷酸碱基,不能很好地保证PCR产物的保真性,并且对于短距离PCRTaqDNA聚合酶尚可以,但对于长距离的片段(6kb以上的片段)就无法完成。近年来利用基因工程方法已经获得了缺少5′-3′外切核酸酶活性和具有3′-5′外切核酸酶活性的Taq酶,从而拓宽了Taq酶的应用范围[19]。由于TaqDNA聚合酶的发现,PCR技术才真正得以推广和应用。

4　有校正功能的耐热DNA聚合酶应用于PCR技术

自PCR技术问世以来人们一直在不断地寻找酶学性能好、保真度高的PCR用DNA聚合酶。继TaqDNA聚合酶之后,人们又陆续发现了Vent1、Deep、Pfu、Tgo和KOD1等耐热的有校正功能的DNA聚合酶。

PfuDNA聚合酶是从喜温的古细菌Pyrococcusfuriosus中获得,因其超强的纠错功能等特性受到人们极大的关注。该酶为2个蛋白亚基(P45和P50)的多聚体,含775个氨基酸,分子量为90KD[18]。

PfuDNA聚合酶热稳定性极强,有5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切核酸酶活性,所以在催化聚合反应的同时可纠正聚合反应过程中的错误掺入。Pfu酶以其比其它校正酶低2～60倍、比TaqDNA聚合酶低6～100倍的低错误率显示出极高的保真度,所以与其它的聚合酶相比,它使产物的错配率大大降低,特别是进行2kb以内的DNA片段的扩增,效果甚佳。

来自PyrococcusSp1的KOD1是另外一个具有强的校正功能DNA聚合酶。其聚合酶基因含有一个由5013个碱基组成的开放阅读框,编码1671个氨基酸,分子量为19312KD,比已知的其它耐热DNA聚合酶平均分子量大许多,其氨基酸序列与来自于Thermococcuslitoralis的TliDNA聚合酶有78%的同源性。该酶属于聚合酶家族的A群,具有很强的3′-5′外切酶活性,而没有或有极弱的5′-3′外切核酸酶活性[20-21]。KOD1酶热稳定性极强,在95℃和100℃的活性半衰期分别是12h和3h,其最适延伸温度为75℃,延伸反应的最适pH是615,单核苷酸聚合反应的错误掺入率与Pfu酶的相当,但是具有比Pfu酶高的延伸速率和持续合成能力[20]。

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