应用于PCR技术的DNA聚合酶(3)

关于酶学

Thermococcusgorgonarius是生活在新西兰地热火山口中的硫代谢极端嗜热古细菌,从其中分离纯化的TgoDNA聚合酶也具有强的耐热性。其晶体结构显示具有5′-3′聚合酶活性域、3′-5′核酸外切酶活性域和热适应结构域[22]。氨基酸序列分析表明TgoDNA聚合酶与Pfu酶有高达82%的同源性,具有与Pfu酶相当的扩增效率和扩增忠实性。其聚合酶活性和3′-5′核酸外切酶活性共同保证了高温复制功能和高保真性(错误率:313-212×10-6)。

上述DNA聚合酶因其固有的高保真性和其它独特的生物化学特性已被应用于各种分子生物学研究中,如平端克隆、富含GC碱基对模板的扩增、突变检测、粘末端克隆和定点突变等。它们的发现和使用不仅极大促进了PCR技术的发展和广泛应用,也使其成为分子生物学研究的重要工具。

可是Tgo等DNA聚合酶也存在着一些缺陷。目前已发现与TaqDNA聚合酶相比较,酶的延伸速率较低,其原因是酶本身低的聚合效率和来自于3′-5′核酸外切酶活性的干扰;对于长距离模板的扩增尚不能很好地实现,主要原因是由不能及时纠正或难于纠正的错配引发的“关闭”DNA聚合反应[23224];反应实现的最佳条件比Taq酶的严格等。为此,我们从嗜热古细菌Thermococcusgorgonarius中克隆了TgoDNA聚合酶基因,并利用基因工程技术对聚合酶基因进行了改造,建立了重组TgoDNA聚合酶的大肠杆菌高效表达体系,表达和纯化了新型重组酶,建立了重组TgoDNA聚合酶的PCR扩增方案,并检测了重组酶的部分特性[25-27],获得了新型高活性、高保真和长距离的TgoDNA聚合酶。

5　耐热DNA聚合酶应用于PCR技术所遇问题及展望

酶的开发利用是现代生物技术的重要内容之一。利用基因重组以及定点突变等技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因是生物酶工程的主要内容。

近年来随着以测序为主要内容的人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)完成,HGP已进入了以基因功能研究为主的功能基因组学和蛋白质组学研究阶段,预计在未来10～20年里,人类将解读绝大多数模式生物的遗传密码。对于基因组功能的研究是人类系统、全面地解读和研究生命遗传物质的宏伟计划,具有重大的科学意义、经济效益和社会意义,因此世界各国都投入巨大的资金用于此项研究。但是,目前的主要困难之一是普通耐热聚合酶对高GC和高AT碱基对含量基因组DNA和cDNA扩增困难,还不能实现对上述特点基因组DNA和cDNA的顺利扩增,并且到目前为止尚无较好的解决办法[28-30],故综合研究聚合酶改善其酶学性能,通过获得适于扩增高GC和高AT碱基对含量基因组DNA和cDNA的聚合酶,解决上述基因组研究过程中的问题,具有一定的理论意义和实际应用价值。

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