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文章编号:1007-8738(2010)04-0404-03

1　噬菌体抗体库的种类和技术发展

噬菌体抗体库技术是指利用分子生物学手段将外源

DNA片段插入噬菌体基因,与编码噬菌体外壳蛋白的基因相

噬菌体抗体库技术及其应用

吴懿娜,杜欣军,张伟伟,董　峰,王　硕3

(天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全省

连接,通过侵染宿主,在噬菌体表面表达成融合蛋白的过程,经过对目标分子如蛋白、糖蛋白、病毒及小分子物质等的特异性结合筛选过程,从而富集得到针对的目标分子的噬菌体展示抗体。

1.1　噬菌体抗体库的分类　(1)根据插入基因片段的来源噬

部共建教育部重点实验室,天津300457)

[关键词]噬菌体展示;抗体库;小分子物质[中图分类号]Q789　　　[文献标识码]A

菌体抗体库可以分为免疫抗体库和非免疫体抗体库,非免疫抗体库又可以分为天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。第一个合成的噬菌体抗体库是Barbas等1992年报道将合成的一小段CDR3片段、人的49个胚系VH、一个J片段利用PCR技术与人的λ轻链连成scFv构成外源DNA插入噬菌体的外壳基因中获得的。(2)噬菌体抗体库的构建可利用的载体主要包括丝状噬菌体、Lambda噬菌体、T7噬菌体及

T4噬菌体。丝状噬菌体中M13为最常用的单链丝状噬菌体

　　目前,抗体在在临床医学研究和食品环境安全检测等方面应用广泛,随着分子生物学的不断发展,利用基因工程手段获得基因工程抗体的方法成为抗体技术研究的热点,自从

Smith于1985年第一次成功地将EcoRⅠ核酸内切酶基因插入

丝状噬菌体基因pⅢ中,并在噬菌体表面表达出了融合的蛋白,及1990年McCafferty等又在此基础上构建了库容为10

6

载体[1];T7噬菌体具有两个双链臂,外源基因可插入双臂间,经体外包装后可直接侵染大肠杆菌,获得抗体库,目前应用也较为广泛[2];T4噬菌体是一种新型噬菌体展示系统,外源基因与其小衣壳蛋白SOC基因相连表达成为融合蛋白,其病毒颗粒不需要经过宿主分泌,而是直接在宿主细胞内组装,是一种用于无法通过大肠杆菌分泌来获得抗体的羧基端展示的噬菌体展示系统;λ噬菌体的展示区域是尾部蛋白PV的C端折叠区,或其头部组装蛋白D的N端或C端,也是一种在宿主细胞内完成组装的噬菌体展示系统。

1.2　插入基因片段的类型　scFv是目前最常用的插入片段

的抗体库,并从中成功地筛选出了溶菌酶单链抗体后,噬菌体抗体库技术成为了抗体工程中的一种新兴的抗体制备的手段。我们将从技术概念与方法、应用方向及研究进展等方面对噬菌体抗体库技术进行综述。

收稿日期:2009-11-23;　接受日期:2010-01-05

基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006AA10Z448);

国家自然科学基金资助项目(20905058)

作者简介:吴懿娜(1985-),女,天津人,硕士

E2mail:ynwu517@http://www.77cn.com.cn

形式,此外还存在其他结构的抗体基因,如dsFv、Fv、Fab和

有用

)2基因。F(ab’

1.3　目标抗体的筛选　工程抗体的体外成熟对医疗领域具

405

血栓疾病等。

在药物研究方面,Saha等[9]对结核病的治疗药物进行了研究,其中结核分枝杆菌是结核病的致病因之一,其中的重要蛋白之一是相对分子质量为16kDa的热休克蛋白16.3,研究者利用M13噬菌体抗体库筛选了对其亲和的抗体,为结合病的药物治疗奠定了良好的基础。Kato2Takagaki等[10]利用噬菌体抗体库对血栓形成相关的血小板上的受体位点糖蛋白6GlycoproteinVI(GPVI)与其他物质的亲和能力进行了研究,。Hyde2DeRuy2

scher等

[11]

有重要的作用,通过噬菌体抗体库的筛选是抗体体外成熟的其中一种方式,通过不断地筛选,从而促使阳性克隆不断地富集。最常见的筛选方法包括固相筛选、生物素筛选和液相筛选等。Burmester等

Yuan等

[4]

[3]

构建了青霉素免疫单链抗体库,并利

用免疫试管包被transferrin2EMCS2ampicillin进行抗体的筛选。

从7个不同的人种,共47个健康人类的血液中提

取基因,构建了人源天然scFv噬菌体抗体库,并利用细胞筛选的方法获得anti2MISIIR单链抗体分子。

1.4　目标抗体的表达　目前,外源基因的克隆表达主要有

,两种途径,即原核表达及真核表达,原核表达主要是通过大肠杆菌进行表达,真核表达主要是通过酵母菌进行表达,毕赤酵母菌;E.coil菌种进行表达,如HB2151、pM。

,等[[13]针对流感病毒H9N2构建了噬菌体,为抗流感病毒药物的研制提

[14]

供了良好的基础。Alvarez2Rueda等通过骆驼免疫抗体库

2　如医疗制药、基于ELSA技术的食品和环境的安全检测及蛋白质相互作用等。

2.1　在医疗制药方面的研究应用　在临床医疗研究方面,Lafaye等

[5]

淘选出了抗甲氨蝶呤的展示抗体,经过序列比对,与人类的

IGHV3基因相似。

2.2　在食品环境检测中的研究应用　Zhao等

[15]

利用噬菌体

抗体库成功筛选得到了低分子量环境毒素2微囊藻毒素的目标抗体,为环境中小分子毒素的研究提供了新的途径。Li等[16]以pCANTAB5E为噬菌体载体,构建了甲胺磷的小鼠免疫抗体库,利用ELISA的方法筛得了三个阳性克隆并进行了可溶性表达。Brichta等[17]利用天然噬菌体抗体库对2,42D除草剂进行了筛选研究。Li等[18]利用mecoprop除草剂及阿特拉津atrazine、西玛津simazine、异丙隆isoproturon3种除草剂衍生物的4种半抗原的混合免疫原免疫兔子,成功构建了

scFv免疫抗体库,并筛选出分别对这4种小分子具有高特异

对导致老年痴呆症的β淀粉神经毒性低聚物进行

了研究,并利用骆驼免疫单链抗体库对该低聚物进行抗体的亲和筛选,研究结果表明获得的抗体可能并不识别传统的结合位点,同时也为该疾病的免疫诊断提供了研究基础。

Houimel等

[6]

构建了狂犬病毒的免疫噬菌体抗体库,为狂犬

病的预防和治疗奠定了基础;另一方面,通过噬菌体抗体库获得的抗体片段较小,容易进入肿瘤的微血管壁,并携带药物到达靶位,如具有生物活性的功能蛋白2毒素、细胞因子和酶等,因此多用于抗肿瘤药物载体的研制。盛唯瑾等

[7]

性的抗体片段。Shaw等[19]利用羊的免疫噬菌体抗体库对贝类毒素软骨藻酸(DA)进行了筛选研究。Nagumo等[20]通过噬菌体抗体库技术对雪卡鱼毒素进行了亲和筛选研究。

2.3　在蛋白质与蛋白质相互作用方面的研究应用　噬菌体

通过

高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,利用

M13噬菌体构建了免疫抗体库,将通过富集筛选获得的阳性

克隆进行体外表达,获得了抗EGFR的特异性scFv,为靶向

EGFR的生物治疗与抗体药物的研究提供了导向载体分子。

抗体库也可应用于蛋白质与蛋白质相互作用方面,Smith等利用噬菌体抗体库技术获得42乙酰氨基苯酚的亲和肽,对低分子量蛋白质之间的相互作用进行了相应的研究,为传感器的研究提供了实验依据。孔波等利用pHEN12KM13噬菌体展示系统表达了融合的谷胱甘肽S转移酶,并通过已知的小分子蛋白与该重组大蛋白进行相互作用,证明了表达的该大分子量重组蛋白具有生物活性。

在抗病毒医疗研究领域,就噬菌体抗体库的特点,可以进行大量的针对不同病毒的多种抗体株的分离,到目前为止,已经利用噬菌体抗体库筛选出了多株抗SARS2CoV的噬菌体抗体[8],另外,由于病毒的变异率高,因此通过抗体库筛选出的抗体很快会失去效力,而近来针对此发展出一种新的筛选方法,即连续抗原筛选(sequentialantigenpanning,

SAP)得到了发展,以期望得到能够识别多种抗原同时具备的

3　结语

近年来对噬菌体抗体库的不断研究,目的就是要获得目标抗体能以应用于医疗制药及安全检测等的多个领域。然而目前所获得的噬菌体展示抗体亲和力较低,而且也不足以应用于临床治疗,因此科研工作者一直努力地通过提高噬菌体抗体库的库容和多样性、优化筛选方法及筛选所用抗原等途径,来获得高亲和力的噬菌体抗体,为噬菌体展示抗体的广泛应用奠定了基础。

保守表位的抗体,从而获得广泛性抗病毒的抗体,虽然通过抗体库所得到的抗体还未有在抗病毒的临床治疗上得到应用,但是已经开始了广泛的研究,在抗HIV、HBV及其它病毒的研究方面都有进一步的进展,目前已经可以通过肝炎表面抗原建立噬菌体抗体库[2],从中筛选并表达人源抗体;在其它疾病治疗方面,也有很多利用噬菌体抗体库进行初步研究,如禽流感、类风湿关节炎及与抗血小板表面蛋白相关的

有用

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