DNA条形码技术在生物分类学中的应用前景

第５０卷第５期

２０１１年３月

Ｈｕｂｅｉ

湖北农业科学

Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ

Ｓｃｉｅｎｃｅｓ

Ｖ０１．５０Ｎｏ．５

Ｍａｒ．，２０１１

ＤＮＡ条形码技术在生物分类学中的应用前景

焦明超，赵大显，欧阳珊，吴小平

（南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌３３００３１）

摘要：ＤＮＡ条形码（ＤＮＡｂａｒｅｏｄｉｎｇ）

术作为近年来发展起来的一门物种鉴定的新兴技术．已引起越来

越多的关注。这一技术的主要目的是鉴定已知物种和发现的新物种。ＤＮＡ条形码提供了可信息化的分类

学标准和更加敏感的分子差别模式．相对于传统生物鉴定的优势在于可以揭示隐存种．鉴定缺少形态数

据或形态不易区分的种类．为物种鉴定提供简单有效的工具。综述了ＤＮＡ条形码技术的产生、发展和基

本原理以及在生物分类学中的应用及存在的问题。

关键词：ＤＮＡ务形码技术；生物分类学；ｍｔＣＯＩ；物种鉴定中图分类号：Ｑ１９

文献标识码：Ａ

文章编号：０４３９—８１１４（２０１１）０５－０８８６—０５

ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｆＤＮＡＢａｒｃｏｄｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＴａｘｏｎｏｍｙ

ＪＩＡＯＭｉｎｇ－－ｃｈａｏ，ＺＨＡＯＤａ－ｘｉａｎ，ＯＵＹＡＮＧＳｈａｎ，ＷｒＵＸｉａｏ－ｐｉｎｇ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅ

ＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｃｈａｎｇ

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长期以来．生物分类学家一直在寻找能够迅速区分不同物种的方法。传统的分类学主要依赖形态或者解剖学特征．这些特征往往对形态近似种的鉴定较网难．且可能出现错误。如果每个物种都携带有表明自己身份的“条形码”．那么物种分类和鉴定工作将得到极大的简化。在这种情况下。ＤＮＡ条形码（ＤＮＡＢａｒｃｏｄｉｎｇ）技术应运而生。１

行性．他们的Ｔ作推动了条形码技术在生物物种鉴定中的应用。２００３年３月，２０多位分类学家、分子生物学家和生物信息学家汇聚美国冷泉港．召开了题为“Ｔａｘｏｎｏｍｙ

ａｎｄ

ＤＮＡ”的会议．提出对全球所有

生物物种的某个特定基因进行大规模测序．以期实现物种鉴定的目标．进而推进生物进化历史的研究。同年９月，在冷泉港再次召开题为“Ｔａｘｏｎｏｍｖ．

ＤＮＡａｎｄ

ｔｈｅｂａｒｃｏｄｅｏｆ

ＤＮＡ条形码技术的产生和发展

Ｔａｕｔｚ等［１－３１首先提出运用ＤＮＡ序列作为生物

ｌｉｆｅ”的会议．对ＤＮＡ条形

码鉴定所有真核生物的科学性、社会利益有了更深入的探讨。并且提出了组织策略及国际生物条形码计划（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ

ｂａｒｅｏｄｅ

ｏｆｌｉｆｅ

分类系统的主要平台，即ＤＮＡ分类学（ＤＮＡ

ｔａｘｏｎ．

ｐｒｏｊｅｅｔ）的发展蓝

ｏｍｖ）的观点。２００３年初，Ｈｅｂｅｒｔ等［４＇５］首次提出用一种基因的序列作为鉴别不同物种的条形码，并选中Ｃ０１基因．随后探讨该技术在鸟类分类鉴定中的可

图。２００４年秋，美国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）与生命条形码联盟（ＣＢＯＬ）签署合作。物种条形码的标准ＤＮＡ序列及其相关数据将存档于ＧｅｎＢａｎｋ。随

收稿日期：２０１０－－０８—０５

基金项目：国家自然科学基金项目（３０８６００４５）；鄱阳湖环境与资源利用教育部首点实验室项目（Ｚ０３９７６）

作者简介：焦日）１１／１（１９８７一），男，湖北孝感人，在读硕士研究生，主要从事动物资源与分子系统学的研究，（电话）１３４７９１６５２８７（电子信箱）

ｍｃｊｉａｏ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；通讯作者，吴小平，教授，（电子信箱）ｘｉａｏｐｉｎ９９１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。

万方数据

第５期

焦明超等：ＤＮＡ条形码技术在生物分类学中的应用前景

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后，ＧｅｎＢａｎｋ提供的Ｃ０１序列数迅速增长．突出表现在除脊索动物之外各类群Ｃ０１序列数量的剧增．目前脊索动物的分类基本上都已经完成。２００５年２月。伦敦举办了第一届全球ＤＮＡ条形码会议．对ＤＮＡ条形码的分类理念、实验技术的细节分析以及资料库建立等议题进行了讨论。最终目的是联合各个类群的ＤＮＡ条形码数据库组建～个全球生物的ＤＮＡ条形码数据库．将此数据库设置在ＧｅｎＢａｎｋ中．让公众可以自由登录查询［６’引。２

ＤＮＡ条形码技术的原理

ＤＮＡ条形码技术是通过对一个标准目的基因

的ＤＮＡ序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。ＤＮＡ序列由Ａ，Ｔ，Ｃ。Ｇ４种碱基组成．如果有ｎ个碱基，就会有４ｎ种编码方式。如果按照这个公式计算。１５个碱基位点就能出现近１０亿种的编码序列．这个数字是现存物种的１００倍。由于自然选择的原因。某些位点上的碱基是同定的．从而导致可能的编码组合数减少。这可以通过只考虑蛋白编码基因来解决．因为在蛋白编码基因里。由于密码子的简并性．其第三位碱基通常都不受自然选择作用的影响，是自由变化的。一个长度３００ｂｐ的蛋白质编码基因的核苷酸片段在第ｉ密码子位点含有１００个核苷酸．这些位点上发生的替代通常都是中性选择．并且大多数都是通过随机漂变在种群中固定下来的。在这１００多个位点上就存在４１００种可能性．为随后的序列比对分析提供了较大的可能性。随着分子生物学技术的飞速发展．获得１００多个碱基序列变得非常容易。

理想的ＤＮＡ条形码应当符合下列标准【３］：①具有足够的变异性以区分不同的物种：⑦同时应具有相对的保守性，以便于用通用引物进行扩增；③必

须是一段标准的ＤＮＡ区来尽可能鉴别不同的分类

群；④目标ＤＮＡ区应当包含足够的系统进化信息

以定位物种在分类系统（科，属等）中的位置：⑤目标ＤＮＡ区应该足够的短．以便有部分降解的ＤＮＡ扩增。

ｍｔＤＮＡ是一种闭合的、双链环状的核外遗传系统．是真核细胞中分子量较小而又较易纯化的复制单位．线粒体基因没有内含子，没有等位基因重组事件．是母系遗传的单倍体，并且线粒体基因的通用引物能够扩增绝大多数的动物物种．因此比核基因更有优势。

线粒体基因组１３个蛋白编码基因的长度在动物界中变化很小（图１…），基于长度差异的考虑．９００ｂｐ左右最适合现有的技术条件，其中，只有ＣＯ／，

万方数据

图ｌ线粒体全基因组序列图解

Ｃｙｔｂ，ＮＤ４，ＮＤ５这４个基因满足上述条件…。考虑到Ｃ０１和Ｃｙｔｂ的进化速率比ＮＤ４和ＮＤ５慢．首先．进化太快就不可能设计出通用引物．也就限制了它作为ＤＮＡ条形码的标记基因：其次．由于进化速率过分远源物种的分类关系．ＣＯ／和Ｃｙｔｂ都拥有合适的

序列长度和适宜的进化速率．但ＣＯＩ相比Ｃｙｔｂ更具

有优势，表现在：Ｏ）ｃｏ／的通用引物能够扩增大多数的ＣＯＩ－５’序列；②ｃＤ，序列拥有更多的系统发育信

号，更适合于分析亲缘关系密切的分类类群。

因此．通常选择ＣＯＩ作为ＤＮＡ条形码的标记

基因．对那些ＣＯ／不能有效鉴定的物种．可以考虑

使用其他片段作为辅助标记基因．

ＤＮＡ条形码技术在生物分类学中

的应用

ＤＮＡ条形码技术在植物分类学上的研究进展ｒＤＮＡ）和６５个广义形态学形状重建毛茛目的系

ＤＮＡ条形码技术在动物分类学中则得到更广３。Ｈｅｂｅｒｔ

快引发碱基发生二次突变．导致数据信息不能够区

３相对较慢。植物的线粒体ＤＮＡ因杂交和基因渗入而变异很少．不适合用作标记基因片段．利用线粒体基因通常不能成功鉴别物种【１０］。依据某一个片段也不可能准确鉴定所有的植物物种．因此．研究者提出了不同的片段组合方案：ＩＴＳ＋ｔｒｎＨ－ｐｓ６Ａ、ｒｐｏＣｌ＋ｒｐｏＢ＋ｍａｔＫ和ｒｐｏＣｌ＋ｍａｔＫ＋ｔｒｎＨ－ｐｓｂＡ等。任宝青等，ｌｏ 利用４个ＤＮＡ片段（ｒｂｃＬ、ｍａｔＫ、ｔｒｎＬ—Ｆ，

２６Ｓ

统发育关系．并更新了毛茛目的分类系统。随着ＰＣＲ技术和ＤＮＡ测序技术的快速发展．ＤＮＡ条形码技术将在植物分类学中扮演更加重要的角色。

泛的应用，几乎涉及动物各类群的分类［６－１３等…选取Ｃ０１基因的一段序列对动物中的７门８目

湖北农

业科学

２０１１年

的不同种群进行种类鉴定，发现无论在门、目，还是在近缘种水平。该基冈都具有较好的鉴定功能。近年来．随着相关研究Ｔ作的开展．进一步确立了以ＣＤ，基因为基础的ＤＮＡ条形码技术的有效性。很多国际组织自行建立的ＤＮＡ条形码数据库构成整个ＤＮＡ条形码项目的重要组成部分．有较大影响或规模的组织包括ＡＬＬ

Ｌｅｐｓ、ＦＩＳＨ ＢＯＬ、ＣａｎａｄｉａｎＦａｕｎａ

别结果更精确。客观；②能在生物不同生长阶段取样鉴别：③利用生物体小块组织鉴别，如通过鉴别胃里的食物小块重建食物链；④不需要专门的物种

鉴定专家．只需要设计好鉴别的实验流程，鉴别过

程是可以机械重复的：⑤鉴别过程迅速，量大，一个

标准ＤＮＡ数据库的建立．利用试剂盒，ＰＣＲ仪等基础实验设备．可以一次性鉴定大量的标本。

当然．ＤＮＡ条形码技术在物种鉴定中体现快速、高效的同时．也避免不了技术上的缺陷，主要表

和Ｂｉｒｄｓ等。６，１２］。同样．ＣＯｌ基因特定片段作为ＤＮＡ条形码在真菌的鉴定研究中也取得了有价值的结果。有学者对Ａｓｅｏｍｙｅｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｅｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄ．ｉｏｍｙｃｏｔａ等的３１个真菌物种的Ｃ０１基因进行了研究，结果显示约６００ｂｐ的ＣＯｌ基因片段长度可以准确鉴定真菌物种．表１总结了ＤＮＡ条形码技术在生物分类学中的应用现状。４

现在：①如何选择合适的基因标记序列，作为ＤＮＡ

条形码的标记基因．一方面应该足够保守．以便于能够利用通用引物扩增大范围的物种．另一方面要包含足够的变异可区分不同物种。理论上不存在普遍适用的标记基因．因此在鉴别不同的物种种类

ＤＮＡ条形码技术在生物分类学应

时，需要根据实际情况选择标记基因。②如何确定

不同长度的ＤＮＡ序列对物种进行有效区分的意义：该技术是否适合区分关系密切或快速进化的物种等需要进一步验证。ＤＮＡ条形码技术主要是对物种进行鉴定．重点在于种内和种间差异的限定．但种内和种间定义并不太明确．不同物种的变异范围并不一样．没有一个统一的标准界限。此外，碱基的二次变异．线粒体ＤＮＡ的修剪机制，对快速进化物种和杂交新品种在鉴定上带来『目难．近缘物种间的基因交流．同属物种间较低的差异也会给物种分类鉴定带来困难。另外．植物的线粒体ＤＮＡ因杂交和基因渗入而变异很少．利用线粒体基因通常不能成功地鉴别．这些类群的标记基因至今仍没有明确报道．需要进一步探讨。

用中的优势及存在的问题

形态学分类有其局限性…：例如。表型可塑性和遗传可变性容易导致鉴定不准确：形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元：形态学鉴定受生物性别和发育阶段的限制．因此很多生物很难鉴定。同时．分类学家识别能力也有局限性，能够正确鉴定１０００个物种的分类学家极少．对地球上ｌ亿，１０亿个物种而言就需要１万～１０万个分类学家来支撑这个物种的识别体系。

ＤＮＡ条形码技术在弥补传统分类不足上的潜力巨大。它提供了一个更加敏感、精确、客观的分子

差别模式。其优势表现在：①鉴别过程快速简便。鉴

表１

ＤＮＡ条形码技术在生物分类学中的应用列举

万方数据

第５期

焦明超等：ＤＮＡ条形码技术在生物分类学中的应用前景

用ＤＮＡ条形码指导发现新物种也同样存在争议。例如使用线粒体ＤＮＡ对动物进行生物地理学和系统学分析时经常会得到与形态学研究不一致的结论．这也使得研究者不得不重新对研究对象的形态、生态和行为等特征进行描述。分子条形码序列数据只是提供一个未知物种区别于其他样本物种的关键证据．但鉴定物种同样需要详细的形态学研究为ＤＮＡ序列提供可靠的参考。由于许多稀有物种缺乏分子数据．因此用形态学来鉴定这些物种仍是必要的。所以，在鉴定物种时。不能完全抛弃形态学手段，必须将条形码技术与形态学手段有机地结合起来…。５

ＤＮＡ条形码技术对隐存生物多样

性的研究

隐存生物是指外观相似，遗传特征截然不同的

物种。过去２０年．由于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ测序技术的日益成熟．人类获得的其他物种的基因组图谱越来越多．科学家发现的隐存种的数量也在急剧增长。Ｈｅｂｅｒｔ等…为２６０种北美鸟类排出了ＤＮＡ条形码序列。结果发现．每只鸟都有单独的条形码．种间差别平均比种内不同个体间的差别高出１８倍。另一项研究中．有学者【１５’１６３曾运用ＤＮＡ条形码证实了在哥斯达黎加原认为１种的常见蝴蝶（Ａｓｔｒａｐｔｅｓ隐存生物是生物多样性中尚未被人们准确认识的重要部分．它们涉及到生态学研究的各个领

域。①在某些特殊的生态系统中．物种不明确往往造成对生态系统功能研究的缺失。②一个包含隐存

种的濒危复合群体．模糊了群体中该物种的真实数量，对保护政策制定起了误导作用。③环境监测中．隐存种对污染的反应可能不一致．影响监测的准确性。例如．用于污染监测的贝类由于各个隐存种的

存在。可能对污染的反应并不一致。④运用ＤＮＡ条

形码技术对某些特殊物种进行重新划分．不仅是学术问题，在实际应用上也有重要意义。２０世纪初。划分蚊子种类时的失误导致了对疟疾控制的混乱：原本被划分为一个物种的蚊子竞包含了６个不同的种类．而其中只有３种传播疾病［３７１。因此，运用ＤＮＡ条形码技术对隐存生物的研究将对生物多样性的评估、野生动物的管理、物种进化甚至传染性疾病的认识与治疗产生极大的影响。

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（责任编辑昌炎新）

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（上接第８８５页）

导率也有一定的影响．正放比反放的愈伤组织诱导率高３１．７１％１１３】。造成这种差别的原因．可能是由于正放．盾片吸收层完全接触培养基．可以直接从培养基中获得大量的营养物质和激素．促进了愈伤组织的产生和增大．提高了愈伤组织的诱导率．其结果与在其他方面的报道一致【１４ｔ１－ｓ］。

通过以上综述我们可以看出．经过多年的努力．小麦成熟胚愈伤组织的培养已取得了很大进展。但由于影响成熟胚愈伤组织诱导分化的因素众多．对于不同小麦品种而言。要获得较为理想的可用于遗传转化的愈伤组织，仍有待进一步探索。

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（责任编辑昌炎新）

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