动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定

生化实验。

动物组织基因组DNA 的分离纯化及鉴定1. 猪肝基因组DNA分离 2. 核酸的定量和纯度测定 3. 脱氧核糖的显色实验

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核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞 的重要成分。它以与蛋白质结合的形式--核蛋白存在于细胞中，是生 命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是 蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变 异等现象起着重要的决定作用 核酸分为两大类--核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖(核糖或脱氧核糖) 和磷酸的混合物 核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和 一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子 磷酸 核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定

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DNA和RNA的结构

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基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交 (包括RFLP)及PCR分离基因等。 利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分 子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子 DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小 分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的 目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片 段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减 少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。 不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法 有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含 的成分不同，分离方法也有差异。

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1. 猪肝基因组DNA的分离核酸分离的原则在溶解细胞的基础上，利用有机溶剂抽提蛋白 质(核酸溶于缓冲液，即水相),分离，纯化；利 用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀核酸，收获

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核酸分离的一般步骤1 溶解细胞 溶解细胞的方法因样品不同而不同，如十二烷基硫酸 钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)加EDTA法、蛋白酶消化法、强 碱法、超声破碎加冻融等。 2 有机溶剂抽提 苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在 水相，达到分离核酸的目的。 3 纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去 RNA,得到纯的DNA;用DNA酶除去DNA,得到纯的RNA。 4 沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷 乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用70%-80%乙醇 洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的 酶促反应。

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核酸分离试剂盒:可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或 RNA,其分离原理是在特定溶液环境下(高

盐、 低pH)使核酸吸附在固相介质(一般是硅胶膜)上， 洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到 纯水或TE中，以达到分离、回收核酸的目的。

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盐溶法分离DNA和RNA的原理根据RNA与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度 不同进行分离： 在0.14M的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大， 而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中， DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小， 从而使DNA和RNA核蛋白分开。 然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来， 再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离 DNA和RNA的目的。

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酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性， 能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并 用Tris平衡至pH>7.8,以防止DNA分配到有机相。 氯仿：强烈的脂溶性，去除脂类杂质，增加有机相比重。 纯酚的比重为1.07,有机相和水相有时很难分开。加入氯仿 (比重为1.47)可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于 水，可以用氯仿将水相中的酚去除。 异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、 变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。

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实验步骤

1.2g

挤干乙醇后加 1mlSC液溶解

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2. 核酸的定量和纯度测定 紫外分光光度法:定量： 260nm下，1OD相当于50ug/ml双螺旋DNA, 40ug/ml 双链RNA 检测纯度：纯的DNA A260/A280=1.8,RNA为2.0,样品中含 有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。

定糖法: DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法 定磷法: 测定核酸的磷酸部分

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实验方法 1ml SC溶液溶解DNA, 8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离 心管中，用1ml 0.01M NaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再 次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用 A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值(OD<3.0即在测量 范围之内),并计算DNA浓度(1OD=50µg/ml DNA) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8,RNA为2.0。如果样 品中混有RNA,则比值大于1.8;如果样品中混有蛋白质，则比值小 于1.8 若A260/A280比值较为正常，则可确定二苯胺法测量DNA浓度的粗略 稀释倍数，使A260值在2.0左右(DNA浓度约为100ug/ml)

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3. 脱氧核糖的显色实验加热条件下：RNA+浓盐酸+地衣酚 DNA+酸+二苯胺 绿色 蓝紫色

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二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键 断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧 核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二 苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。 DNA

在40~400µg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在 反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

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DNA标准曲线的制作和样品测定管 试 剂(ml) 0 0.0 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 号 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0

DNA标准溶液 (200 µg/ml) H2O 二苯胺试剂

60℃水浴中保温1h,冷却测 OD595 以DNA的含量为横坐标，光密度(吸收值)为纵坐标，绘制标准曲线。注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液 二苯胺法的测定范围是40-400 ug/ml DNA,浓度太小会影响测定结果

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DNA含量计算根据标准曲线,以样品的光密度计算出相应DNA 含量,并同紫外法测定的值进行比较，分析二者差异的 原因。 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝 色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外 面一定要擦干净。