葎草多糖的提取分离及组成性质研究_屠婕红

第31卷第8期2008年8月

Vo.l31No.8Aug.2008

北京中医药大学学报

JournalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine

561

葎草多糖的提取分离及组成性质研究

屠婕红 陈伟光 盛 静 敖 雷(浙江省嘉兴学院医学院 浙江314001)

*

摘要:目的 从葎草中提取分离多糖成分,并研究其组成性质和分子量。方法 经水提醇沉、脱蛋白后的粗多糖,采用SephadexG-100和SepharoseCL-4B柱色谱分离及纯度鉴定,薄层色谱法和气相色谱法测定多糖组成,凝胶色谱法测定相对分子质量。结果 从葎草水溶性多糖提取物中分离得到3种均一多糖(HSP-1、HSP-2、HSP-3),其中HSP-1的单糖组成为核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,它们的摩尔比为0.35 0.32 0.13 0.13 0.29 1.00,HSP-1的平均分子质量为4.3 10。结论 HSP-1为葎草多糖的主要成分,首次从葎草全草中提取获得。关键词:葎草;多糖;提取分离;组成性质;薄层色谱;气相色谱中图分类号:R284.2

4

Extraction,separation,

*

fromHumulusscandens

compositionandpropertiesofpolysaccharide

TUJie-hong,CHENWe-iguang,SHENGJing,AOLei(MedicalSchoo,lJiaxingCollege,Zhejiang 314001)

Abstract:Objective ToextractandseparatethecompositionofpolysaccharidefromHumulusscandens,andstudyitscomposition,propertiesandmolecularweight.Methods Thecrudepolysaccharide,afterthewaterextracting-alcoholprecipitationanddeproteinization,wasseparatedandpurifiedbyusingthechromatographiccolumnsofSephadexG-100andSepharoseCL-4Brespectively.Thecomponentsofpolysaccharideweredeterminedbyusingthinlayerchromatography(TLC)andgaschromatography(GC).Therelativemolecularweightofpolysaccharidewasdeterminedbyusinggelchromatography.Results Therewere3kindsofhomogeneouspolysaccharides(HSP-1,

HSP-2andHSP-3)

separatedfromtheextractofwatersoluble

polysaccharideofHumulusscandens,amongwhichthemonosaccharideofHSP-1consistedofribose,arabinose,xylose,mannose,glucoseandgalactosewiththemolarratiobeing0.35 0.32 0.13

4

0.13 0.29 1.00.TheaveragemolecularweightofHSP-1was4.3 10.Conclusion HSP-1isthemaincomponentofpolysaccharideofHumulusscandens,whichisextractedfromwholeHumulusscandensforthefirsttime.Keywords:Humulusscandens;polysaccharide;extractionandseparation;componentsandproperties;thinlayerchromatography;gaschromatography 葎草又名拉拉秧,为桑科植物葎草Humulusscandens(Lour.)Merr.的干燥全草,具有清热解毒、利尿消瘀等功效,它资源丰富,生命力旺盛,在我国南北各地均有分布和生长,是农田和园林绿化中

[1]

的重要杂草,可能含有抗衰老成分,若能合理开发利用,将会变废为宝。针对葎草活性成分的研究少有文献报道,而多糖又是中药中抗衰老、增强免疫力的主要活性成分,本文对葎草中水溶性多糖成分进行

屠婕红,女,副教授

*嘉兴市科技局基金资助项目(No.2005AY3042)

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了提取分离,并对其主要多糖成分的组成性质作了分析研究,为进一步开发利用葎草多糖奠定了基础。1 材料1.1 仪器

气相色谱仪(岛津14C型,日本岛津公司),紫外分光光度计(UV-2401PC,日本岛津公司),自动收集仪(BSZ-100,上海沪西分析仪器厂),离心机(0412-1,上海手术器械厂),中药粉碎机(RT-08,上海淀久中药机械制造有限公司),旋转蒸发仪(RE-52AA,上海医疗器械厂),真空干燥器(DZF-1B型,上海跃进医疗器械厂),自动旋光仪(WBE-2A,上海精密科学仪器有限公司),电子分析天平(BC-210S,北京赛多利斯仪器有限公司),黏度计(NDJ-9S,上海精密仪器仪表有限公司),高效薄层色谱硅胶预制板(天津药典标准仪器厂)。

1.2 药材与试剂

实验用葎草Humulusscandens(Lour.)Merr.采自浙江省嘉兴学院梁林校区内,由嘉兴学院生药教研室陈伟光副教授鉴定,全草于阴凉处用风扇吹干,粉碎过40目筛备用。SephadexG-100,SepharoseCL-4B,葡聚糖标准品(DextranT-500、T-70、T-40、T-10)和蓝色葡聚糖2000均为Pharmacia公司产品;核糖等7种单糖对照品(进口分装,上海化学试剂公司);其他试剂均为国产分析纯。2 方法

2.1 多糖提取的正交试验

称取葎草干燥粉末10g,用95%乙醇浸泡脱脂,药渣以蒸馏水为提取溶剂,分别以提取时间(A)、提取温度(B)、提取次数(C)和液固比(D)为影响因素,按L9(3)正交设计方案进行试验。提取完成后进行过滤,合并滤液,60 减压浓缩至原来体积的1/4,浓缩液加4倍量的乙醇,冰箱放置24h,抽滤,收集多糖沉淀,减压干燥,计算提取率。每一试验平行操作2次,取平均值进行正交试验结果分析,找出最佳提取条件。见表1。

表1 L9(34)正交设计因素水平表

水平12

3

因素

A/h0.51.01.5

B/ 708090

C/次123

D/倍51015

4

按正交法确定的最佳工艺条件进行葎草多糖提取的

[2]

放大实验,得到的提取溶液,用Sevag法去蛋白,离心除去胶状沉淀(重复8次),至紫外测定在260、280nm处无蛋白质和核酸吸收峰,上清液对蒸馏水透析2d,60 减压浓缩至原来体积的1/4,浓缩液加4倍量95%乙醇使多糖沉淀析出,抽滤,沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤,减压干燥,得葎草粗多糖(PolysaccharideofHumulusscandens,HSP)。称取上述葎草多糖100mg,加蒸馏水溶解,上SephadexG-100柱(2.5cm 60cm)进行色谱分离,蒸馏水洗脱,控制流速0.25mL/min,自动部分收集器5mL/管收

[3]

集,以改良的硫酸-苯酚法跟踪检测,根据洗脱曲线收集、合并含糖部分,浓缩,减压干燥,即得。2.3 纯度鉴定

在凝胶色谱柱SepharoseCL-4B(2.5cm 60cm)上,以1%NaCl洗脱,流速10mL/h,用改良的苯酚-硫酸法跟踪检测,根据洗脱曲线收集、合并含糖部分,绘制色谱图谱,观察结果。2.4 相对分子质量测定

参照文献[4]的方法,采用凝胶色谱法。取0.1mol/LNaCl溶液充分溶胀的SepharoseCL-4B装柱(1.7mm 90cm),用0.1mol/LNaCl溶液平衡3d,先后将已知分子量的葡聚糖标准品(T-500,T-70,T-40,T-10)配制成0.5%溶液,进行凝胶色谱,上样量各2mL,用0.1mol/LNaCl溶液洗脱,流速为6mL/h,按1mL/管分部收集,用改良的苯酚-硫酸法检测多糖,分别求得相应的洗脱体积(Ve)。再用蓝色葡聚糖2000上柱求得柱的外水体积(Vo),以Ve/Vo为纵坐标,lgM为横坐标,得到分子量测定标准曲线。相同浓度待测样品于同条件上柱,求得Ve/Vo值,查标准曲线计算相对分子质量。2.5 多糖的单糖组成分析

2.5.1 样品完全酸水解:取20mg葎草多糖的干燥样品,加入2.0mol/L的硫酸溶液5mL,置120 烘箱中封管水解4h,取出冷却后加碳酸钡中和至pH7~8,3000r/min离心除去硫酸钡沉淀,上清液减压蒸发至干,获得多糖水解物,备用。

2.5.2 硅胶薄层色谱法:参照文献[5]的方法取少量上述水解产物,加蒸馏水溶解,同时取各种标准单糖配成水溶液,分别点样于同一预制硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水(13 3 3 3)为展开剂,苯胺-邻苯二甲酸喷雾显色,110 烘烤10min至显色清晰。. 10m2.2 多糖的纯化与柱色谱分离

500g,95%,

第8期屠婕红等 葎草多糖的提取分离及组成性质研究 563

入20mg盐酸羟胺,2mL吡啶,置90 水浴中加热反应30min并振荡,取出后冷至室温,加入2mL醋酸酐,在90 下继续反应30min进行酰化,生成具有挥发性的糖腈乙酸酯,反应物于旋转蒸发仪中减压蒸干,残渣加入2mL氯仿溶解,过滤。同法制备各种标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物,分别进行气相色谱分析。

气相色谱条件:SE-30弹性石英毛细管柱(0.32mm 30m);柱温100 保持5min,5 /min程序升温至230 ,维持30min;检测器(FID)和进样口温度均为270 ;载气为N2,40kPa。2.5.4 组成单糖的摩尔比测定:以L-阿拉伯糖为内标测定组成多糖的单糖的定量校正因子。精确称取组成多糖的单糖标准物,使标准物与内标的质量之比在0.3~2.5之间的5个不同浓度,按2.5.3的方法进行气相色谱分析。以标准糖和内标的峰面积之比作为横坐标,标准糖和内标的质量之比作为纵坐标求得它们的斜率,即为该种标准糖的定量校正

Wi/Ws

)。因子f(

Ai/As多糖组成中单糖的摩尔比测定条件与测定定量校正因子的条件相同。以L-阿拉伯糖为内标,测定各单糖残基的峰面积,乘以f/M(:f该单糖的定量校正因子,M:该单糖的分子质量)所得的值即为该种单糖的摩尔比值。3 结果

3.1 正交试验结果

以葎草多糖的提取率为指标,正交试验的实验结果见表2。

表2 正交设计结果分析

实验号1

234567891K2K3K1平均K2平均K3平均因素

A/h0.50.50.51.01.01.01.51.51.513.618.014.94.56.05.0B/

70809070809070809015.17.14.5.5.4.C/次12323131210.113.522.73.44.57.6D/倍10203030102020301014.915.915.85.05.35.3

/%2.4.6.5.8.4.7.3.3.374878267502437574

由表2结果显示:C因素对应的极差R最大,其次是A因素,此两因素为影响葎草多糖提取率的主要因素;B因素和D因素影响较小,各因素对提取效果的影响大小顺序是:提取次数(C)>提取时间(A)>提取温度(B)>液固比(D),各因素的最佳水平为:A2,B2,C3,D2。即葎草多糖的最佳提取工艺条件为:用10倍量水,在80 水浴中加热提取3次,每次1h。3.2 葎草多糖的提取结果

500g葎草干燥粉末经水提醇沉,8次Sevag试剂脱蛋白处理,得到葎草粗多糖(HSP)6.09g,得率为1.218%。进一步上SephadexG-100柱分离,得到HSP-1、HSP-2和HSP-3三种多糖成分,其中HSP-1含量最高,约占多糖量的4/5。HSP-1为浅棕色粉末状固体,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂,与苯酚-硫酸试剂、蒽酮-硫酸试剂反应为阳性,与I=2-KI反应为阴性,特性黏度[ ]193.6mL/g,比旋度[ ]D(H2O)为+153.8(c=0.8)。紫外光谱测试表明,在260、280nm处无吸收峰,说明样品HSP-1中不含蛋白质、核酸类物质。经SepharoseCL-4B柱色谱得到的洗脱曲线为单一对称峰,表明HSP-1为单一的杂多糖。3.3 葎草多糖HSP-1相对分子质量

由Ve/Vo对标准分子量的对数关系得标准曲线方程为:Ve/Vo=3.9756-0.4187lgM(r=0.9939),根据HSP-1的洗脱体积171mL,求得HSP-1的相对分子量为4.3 10。3.4 葎草多糖HSP-1含有的单糖成分

HSP-1完全酸水解产物经硅胶薄层色谱表明主要含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和核糖5种单糖成分。

图1为标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图,按出峰先后依此为鼠李糖(26.076min)、核糖(26.665min)、阿拉伯糖(27.332min)、木糖(27.732min)、甘露糖(35.732min)、葡萄糖(36.158min)和半乳糖(37.198min)。HSP-1完全水解物糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱分析(见图2),结果显示6个吸收峰(26.618min、27.232min、27.665min、35.698min、36.065min、37.121min),比较上述两张图谱,表明HSP-1含有核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。薄层色谱和气相色谱比较未能显示木糖,可能是木糖含量较低的缘故。

:,糖1.007

4

20

1

05078

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f.000,f.004,f.998,f阿拉伯糖=1木糖=1甘露糖=0葡萄糖=1.129,f.063。测得葎草多糖组成单糖的摩半乳糖=1尔比为核糖 阿拉伯糖 木糖 甘露糖 葡萄糖 半乳糖=0.35 0.32 0.13 0.13 0.29 1.00。

多糖的主要成分,该多糖由核糖、阿拉伯糖、木糖、甘

露糖、葡萄糖和半乳糖组成。在葎草多糖提取过程中,游离蛋白质也被提取出来,脱去游离蛋白质的方法有Sevag法、三氯乙酸法等,本实验采用比较温和的Sevag法脱葎草多糖中的游离蛋白,以免影响多糖的生物活性。

利用凝胶色谱法测定分子量不需要复杂的仪器设备,操作简便,样品用量少,但误差较大,测得的是近似分子量;用薄层色谱法初步鉴定多糖中单糖的组成,根据多糖组分不同,采用气相色谱法,选择

1鼠李糖 2核糖 3阿拉伯糖4木糖 5甘露糖 6葡萄糖 7半乳糖

图1

标准单糖的气相色谱图

SE-30毛细管色谱柱,衍生化后,再进行测定,此法鉴定单糖的组成,方便可靠,针对性强。多糖生物活性多样,对HSP-1的药理作用我们将进一步进行研究。

参考文献:

[1]尹海波,王 颖,郑太坤,等.中国葎草属植物的研究进

展[J].辽宁中医学院学报,2001,3(1):60-61.[2]朱永智,陈 旭.不同品种、产地淫羊藿多糖的含量测定

[J].天津中医药,2004,21(1):68-69.

2核糖 3阿拉伯糖 4木糖 5甘露糖

6葡萄糖 7半乳糖图2 水溶性多糖的气相色谱图

[3]董 群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖

和寡糖含量的研究[J].中国中药杂志,1996,31(9):550-553.

[4]王 辉,陈泽宇,钟国华,等.海芋多糖的研究[J].华南

师范大学学报:自然科学版,2006(3):92-95.

[5]张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].2版.杭州:浙江

大学出版社,2003:21-30.

(收稿日期:2008-01-11)

4 讨论

通过水提、脱蛋白、透析、醇沉方法从葎草全草中获得不含蛋白质、核酸的葎草多糖粗品,得率为1.218%,经凝胶色谱分离纯化得到的HSP-1为葎草

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