六味地黄丸的HPLC指纹图谱和模式识别研究_赵洪芝

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中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第1期2010年1月

版,2003,2(2):1241

[2] 中国药典[S]1一部120051

[3] 李光甫,任玉珍1中药炮制工程学[M]1北京:化学工业出版

社,20071

[4] 樊绘曾,刘或曦1阿胶蛋白质定量方法的比较[J]1中国中药

杂志,1994,19(4):2241

类药材炙珠的代表性应用。这种可靠的、低成本、高效、环保的炮制胶珠的方法也可在其他中药胶材中

推广应用。

参考文献:

[1] 张保国1阿胶的现代炮制研究[J]1河南大学学报:医学科学

六味地黄丸的HPLC指纹图谱和模式识别研究

赵洪芝

1,2

,孟宪生

3*

,叶挺祥,刘征辉,程 奕

1,21,21,2

,罗国安

3

(11天津海世达检测技术有限公司,天津 300381;21天津市现代中药质量检验中心,天津300381;

31清华大学化学系,北京 100084)

摘 要:目的 研究六味地黄丸的质量控制方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为AgilentZorbaxSBC18

(250mm@416mm,5Lm),乙腈2水梯度洗脱,柱温:30e,体积流量:110mL/min,检测波长为236nm,并利用聚类分析法和主成分分析法分析结果。结果 通过聚类分析将不同厂家和批次的25个样品分为3类,不同剂型的六味地黄制剂HPLC指纹图谱存在明显的差异。主成分分析分类结果与聚类分析分类结果一致,经主成分分析,8个共有峰可综合为3个主成分,其累积贡献率达821844%,马钱苷的相对峰面积为六味地黄丸指纹图谱中影响比较大的指标。结论 此方法可较系统地用于六味地黄丸的质量控制。关键词:六味地黄丸;指纹图谱;模式识别中图分类号:R28412;R286102 文献标识码:A 文章编号:0253-2670(2010)01-0048-04

HPLCFingerprintandchemicalpatternrecognitionofLiuweiDihuangPills

ZHAOHong2zhi,MENGXian2sheng,YETing2xiang

CHENGYi1,2,LUOGuo2an3

1,2

3

1,2

,LIUZheng2hui,

1,2

(11TianjinHigh2standardQualityTestingLaboratary,Tianjin300381,China;21TianjinCenterforQualityTesting

ofTCM,Tianjin300381,China;31DepartmentofChemistry,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)

Abstract:Objective ToestablishamethodforthequalitycontrolofLiuweiDihuangPills1MethodsHPLCMethodwasdevelopedtoestablishthefingerprintofLiuweiDihuangPills1Theseparationwasper2formedonAgilentZorbaxSBC18(250mm@416mm,5Lm)columngradientelutedwiththemobilephaseconsistingacetonitrileandwaterattheflowrateof110mL/min1Thedetectionwavelengthwas236nm1Hierarchicalclusteranalysis(HCA)andprincipalcomponentanalysis(PCA)wereappliedtoinvesti2gatingthetestdata1Results TheHCAresultshowedthat25samplesfromvariousmanufacturersandva2riousbatchescanbedividedintothreegroups1Thedifferencesbetweenvariousdosageformscouldbeob2vious1TheclassificationresultaccordingtoPCAwasconsistentwiththeHCA1ThePCAshowedthateightcommonpeakswereintegratedintothreeprincipalcomponents(PC)andtheiraccumulationcontribu2tingrateamountedto821844%1ThePCAresultshowedthattherelativepeakareaofloganinwasthedis2criminatingfactorofthefingerprintofLiuweiDihuangPills1Conclusion ThismethodcanbeusedforqualitycontrolforLiuweiDihuangPills1

Keywords:LiuweiDihuangPills;fingerprint;chemicalpatternrecognition

¹ 收稿日期:2009203210

基金项目:天津市科技发展计划项目(05SYSYGX25000)

作者简介:赵洪芝(1981)),女,硕士,助理研究员,主要从事中药质量控制及化学计量学方面的研究。

Tel:(022)27950255 Fax:(022)27950378 E2mail:zhaohongzhi@1261com

*通讯作者 孟宪生 Tel:(010)62772263 Fax:(010)62781688 E2vvv@1261com

中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第1期2010年1月

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六味地黄丸是中医补益剂中滋阴补肾的代表方剂,用于肾阴亏损,头晕耳鸣,腰膝酸软,骨蒸潮热,盗汗遗精,消渴等症。其配方由熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、泽泻、山药、茯苓等6味药材组成。5中国药典62005年版一部六味地黄丸项下规定检测丹皮酚和马钱苷的量作为质量控制标准。但是六味地黄丸的成分十分复杂,生产厂家众多,为全面评价其质量,需借助现代分析手段进行研究,建立新的评价方法。中药指纹图谱技术是一种表征中药所含成分与其质量关系的有效手段,现已成为国内外广泛接受的中药质量评价模式[1~4]。本课题组前期采用薄层扫描法评价了六味地黄丸(胶囊)[5]。本实验建立了六味地黄丸的HPLC指纹图谱,结合聚类分析法和主成分分析法等模式识别方法,为中药的质量控制提供一种直观、简便、有效的手段。1 仪器与试药

Watersalliance2695高效液相色谱仪,其配置有自动进样器、2996二极管阵列检测器、柱温箱。乙腈(色谱纯,美国Fisher),超纯水(Milli2pore);其他试剂为分析纯。丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所,批号为1107082200505);马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号为1116402200803)。六味地黄丸(胶囊)样品为市售品,共收集了15个生产厂家的25个样本,见表1。

表1 样品来源Table1 Sourcesofsamples

编号生产厂家批号

剂型

编号生产厂家批号剂型1A6032931水蜜丸14E109426大蜜丸2A7031337水蜜丸15E109429大蜜丸3BB058220水蜜丸16C640005大蜜丸4BB058207水蜜丸17C640006大蜜丸5BB058227水蜜丸18J070101浓缩丸6C6420009水蜜丸19K20060918浓缩丸7C6420011水蜜丸20K20070539浓缩丸8D0506028水蜜丸21K20070611浓缩丸9E111409水蜜丸22L97060379浓缩丸10F0605707水蜜丸23M20070426浓缩丸11G051102水蜜丸24N060701浓缩丸12H060503胶囊 25

O

061274

浓缩丸

13

I

070301

胶囊

2 方法与结果211 色谱条件:AgilentZorbaxSBC18色谱柱(250mm@416mm,5Lm);流动相:乙腈2超纯水,线性梯度洗脱程序:0~8min,乙腈由1%线性增至12%;8~21min,乙腈保持12%,21~40min,乙腈由12%线性增至90%;40min后乙腈保持90%至50min;体积流量:110mL/min;检测波长:236nm;

进样量:10LL。

212 供试品溶液的制备:取本品水蜜丸切碎,取约1g;大蜜丸取约113g;浓缩丸取约013g;胶囊取约015g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,密塞,称定质量,超声提取60min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

213 对照品溶液的制备:精密称取马钱苷对照品、丹皮酚对照品适量,加甲醇分别制成含马钱苷14Lg/mL、丹皮酚18Lg/mL的溶液,即得。214 方法学考察

21411 精密度试验:取同一供试品溶液在上述条件下连续测定6次,计算指纹峰的保留时间和峰面积的RSD值,相对保留时间RSD分别为0123%、0124%、0157%、0164%、01013%、01003%、0125%,相对峰面积RSD为1105%、0182%、0126%、0163%、1163%、1166%、0123%,各色谱峰相对保留时间稳定,各主要色谱峰相对峰面积基本一致,RSD小于210%。

21412 稳定性试验:取同一供试品溶液在上述条件下,分别在0、3、6、9、12、16h测定其指纹图谱,各色谱峰保留时间RSD分别为0122%、0158%、0166%、0101%、0141%、01041%、0128%,各色谱峰保留时间稳定,各主要色谱峰,相对峰面积RSD分别为1169%、0192%、0132%、0149%、1153%、2182%、1102%,均小于210%,表明样品溶液在16h内稳定。21413 重复性试验:平行取6份供试品溶液,进样测定,计算指纹峰的保留时间和峰面积的RSD值,结果相对保留时间RSD分别为01069%、01067%、0112%、01108%、1129%、01027%、01065%,相对峰面积的RSD分别为2182%、1110%、1120%、1193%、2131%、1154%、2142%,各主要色谱峰相对峰面积RSD小于310%。

215 样品测定:取不同厂家的25批样品,分别制备供试品溶液,进样测定,确定8个主要色谱峰为共有峰。马钱苷、丹皮酚对照品色谱图见图1,2号样品的HPLC指纹图谱见图2,用5中药色谱的指纹图谱评价系统6软件(2004A)进行色谱峰的匹配,25批样品的叠加谱图见图3。3 模式识别研究

311 聚类分析法:以25个不同厂家和批次的六味地黄丸(胶囊)为研究对象,进行指纹图谱研究,获得包括丹皮酚(7号峰)在内的8个色谱峰,将7号峰

设为参比峰,规定其相对保留时间和相对峰面积为1,其他各峰面积均按相对峰面积折算,将各色谱峰

相对于内参比色谱峰的峰面积量化,得到25@8阶原始数据矩阵,运用SPSS统计分析软件对其进行聚类分析(Hierarchicalclusteringanalysis),利用欧氏距离(Euclidean)作为样品的测度,采用离差平方和法(Ward'sMethod)进行聚类,将25个样品分为3类,见图4。

可以看出,25个样品总共可以分为3类,其中,16、17、7、2、15、10、14、1、6、9、24为第1类;4、20、3、5、25、19、21、23、22为第2类;12、13、18、8、11为第3类。C厂家的样品(4、7、16、17)和E厂家(9、14、15)无论水蜜丸和大蜜丸均为在第一类中,说明C和E厂家的样品质量相近,而水蜜丸和大蜜丸质量相差并不大。而所取的B厂家样品(2、3、5号)比较紧凑,

证明这几个批号六味地黄丸质量比较稳定。

图4 六味地黄丸(胶囊)样品的聚类谱系图Fig14 Hierarchicalclusteranalysisfigure

ofLiuweiDiHuangPills(Capsula)

12、13号为胶囊制剂,在聚类谱图中距离非常相近,说明胶囊与其他剂型相差较大。浓缩丸除N厂家(24号)和J厂家(18号)以外,均在第2类中,说明

浓缩丸和水蜜丸之间质量有一定差异。

312 主成分分析:主成分分析是将原来众多具有一定相关性的指标重新组合成一组新的相互无关的综合指标来代替原来指标的统计方法,也是数学上处理降维的一种方法[6]。主成分分析有许多同义词,如特征值分解(eigenvectordecomposition)、奇异值分解(singularvaluedecomposition)、抽象因子分析(abstractfactoranalysis)、主因子分析(principalfactoranalysis)、特征矢量投影(eigenvectorprojec2

tion)、K2Lprojection等。本实验应用SPSS统计分

析软件对此25个样本进行了主成分分析,即将它们投影至低维空间来看它们之间的微细差别,先将25@8的原始数据矩阵经标准化处理,再对其进行运算,主成分个数提取原则为主成分对应的特征值大于1的前m个主成分。主成分分析结果如下:第一主成分的特征值K1=31535,方差贡献率为501505%;第二主成分的特征值:K2=11260,方差贡献率为181003;第三主成分的特征值K3=11004,方差贡献率为141336%。3个主成分的累计方差贡献率为821844%,故选取前3个得分矢量来作图,3个主成分的得分图见图5。图中每个点对应1个样本。可知,此25个样本可分为3类,与聚类分析结果一致,即可验证聚类结果图,聚类结果合理。

初始因子载荷矩阵中,每一个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数见表2。将主成分载荷矩阵中的数据除以主成分相对应的特征值开平方根便

图5 主成分得分图

Fig15 Principalcomponentanalysisscore

表2 初始因子载荷矩阵Table2 Matrixofinitialfactors

峰位主成分

1231

01512 01432-01608

2 01886-01265 012703 01928-010397 0101444 01772 01439-011255 01706-01610 011346 01729 01233 011268

-010444

01618

01715

得到两个主成分中每个指标所对应的系数,经计算可得主成分的模型为:F1=01272X1+01471X2+

01494X3+01411X4+01376X5+01388X6-01024X8;F2=01385X1-01236X2-01035X3+01391X4-01543X5+01207X6+01551X8;F3=-01607X1+01269X2+01014X3-01125X4+01134X5+01126X6+01714X8。F1、F2、F3分别表示3个主成分,X1、X2,,X8分别表示各个色谱峰(峰1、2、,,8)的相对于标准峰(峰7)的相对峰面积。而3个主成分中,F1是特征值最大的,即是/信息最多0的指标,而第一主成分中系数最大的为X3,即为峰3相对于峰7的面积,从对照品色谱图(图2)可知,峰3为马钱苷,峰7为丹皮酚,证明马钱苷的量在六味地黄丸的质量控制中起相对比较重要的作用。

4 讨论

中成药系复方制剂,其化学成分甚为复杂,其作用往往是多种成分协同作用的结果,而不仅仅是其

中某几个有效成分的个别功效。本实验对收集到的25个六味地黄丸样品进行了HPLC指纹图谱研究,并使用聚类分析及主成分分析化学模式识别的方法,对其数据进行了分析,两种方法分类结果可以互相印证,表明方法合理,说明将指纹图谱和模式识别结合进行质量控制是一种行之有效的方法。且使用主成分分析表明,马钱苷在六味地黄丸质量中起相对重要的作用,5中国药典62005年版一部的马钱苷、丹皮酚为质量控制指标,有效地控制了六味地黄

丸的药品质量。

在供试品溶液制备条件的选择中比较了回流提取和超声提取、提取溶剂(50%甲醇、甲醇、含1%甲酸的甲醇、乙醇、甲醇2乙醚)、提取时间(15、30、45、60、90min)、样品用量(011、012、015、110、210g)对六味地黄丸的提取效果。结果表明,在指定的色谱分析条件下,本实验中采用的供试品溶液制备方法提取效果最好,能够最大限度地反映其特征。

在色谱条件优化中,经过多次尝试最终确定了乙腈2水的流动相体系,在优化的色谱条件下,样品能够得到较好的分离。为了使尽量多的化合物被检测,采用Waters公司2996检测器及Empower工作站的特殊功能MAXPLOT(最大值图),提取各色谱成分最大吸收的色谱图与不同波长的色谱图进行比较,当选择236nm为检测波长时,色谱成分检出率最多,满足了最大信息量化的原则,所以选择236nm为检测波长。

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[6] 许 禄1化学计量学[M]1北京:科学出版社,20041