小鼠腹水瘤细胞凋亡的诱导及形态学检测

小鼠腹水瘤细胞凋亡的诱导及形态学检测

一、 实验目的

了解凋亡细胞的变化及检测方法。

掌握用普通光学显微镜观察凋亡细胞的方法。

二、 实验原理

喜树碱（ camp tothecin， CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可通过多种机制发挥抗肿瘤作用，其中一种机制就是诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞。 凋亡细胞会发生一系列不同于正常细胞的变化，如核染色质凝集、边缘化、形成不同大小被膜包围的凋亡小体。这些变化适当制片及染色后可用普通光学显微镜观察。

细胞凋亡：是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cell suicide）。形态变化：胞质皱缩，核染色质凝集、分块、边缘化，形成不同大小被膜包围的凋亡小体，最后由细胞表面出芽脱落。

细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。胀亡细胞的形态变化：细胞胀大、体积增大、胞质空泡化；核内染色质分散；胞膜起泡、通透性增加，完整性破坏、直至最后崩解。

检测原理：凋亡细胞的DNA链断裂出现缺口，产生一系列3′-OH末端；末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)识别游离3′-OH末端，将荧光素/酶标记的dUTP结合到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。

三、 实验仪器与试剂

a) 材料：提前7天接瘤，并在实验前24~48h 腹腔注射用生理盐水配制的

羟基喜树碱溶液诱导凋亡。

b) 试剂：

i. 1mg/mL羟基喜树碱溶液。

ii. 0.01mol/L PBS（pH7.2）。

iii. 甲醇。

iv. 3:1甲醇：冰醋酸。

v. 吉姆萨染液应用液。

c) 用品

i. 普通光学显微镜、 10mL低速离心机

ii. 剪刀、10mL一次性注射器及针头、乳胶手套、酒精棉球、10mL离

心管、胶头吸管、EP管、10mL离心管、载玻片、吸水纸、载玻片染

色盒（缸）等

四、 实验步骤

a) 装片观察悬液中的凋亡细胞

用生理盐水适当稀释腹水瘤细胞；制备装片；显微观察。

b) 涂片染色观察凋亡细胞

1500r/min离心5min，弃上清；用含1%小牛血清的生理盐水或PBS（pH7.2）

配制成50%细胞悬液；制备细胞涂片；

甲醇固定3min； Giemsa染色15min；水洗，晾干；显微观察。

五、 实验结果

a) 装片

如图所示，圆圈1内的细胞为胀亡细胞的阴影。胀亡细胞的形态变化：细胞胀大、体积增大、胞质空泡化；核内染色质分散；胞膜起泡、通透性增加，完整性破坏、直至最后崩解。圆圈2当中的细胞为凋亡细胞。形态变化：胞质皱缩，核染色质凝集、分块、边缘化，形成不同大小被膜包围的凋亡小体，最后由细胞表面出芽脱落。图中可以明显看出凋亡小体。

b) 涂片

未诱导的：

如图所示，未诱导的细胞中染色较浅，即凋亡细胞的数量较少。但仍旧有少数的细胞是凋亡细胞，也可以看到胀亡细胞。

诱导的：

如图所示，圆圈当中的细胞可以明显的看出凋亡小体，即为凋亡细胞。

六、 实验分析

a) 实验证明，未经诱导的细胞，在制成装片放置很久以后，凋亡细胞的数

量也会大大增加。因为，细胞凋亡虽是自主的但当有外界因素刺激时导致信号传导,近而控制基因表达生物性状。所以细胞凋亡其实是由外界环境与基因共同决定的。所以，当细胞被制成装片以后，细胞由于外界环境发生变化，而促使更多的细胞启动凋亡程序。

b) 制备各种装片的方法：

i. 切片法：切片法是将欲观察的材料切成极薄的薄片，再制成装片的

一种制片方法。其制作过程：首先选用软硬适度的植物根茎叶等如材料太软，可用马铃薯块茎、胡萝卜根或肥皂将欲切取的材料夹住。一起进行切片。欲切的材料应先截成适当的段块，一般面积大小不超过3－5平方毫米为宜，长度以2－3厘米较便于手持并进行切片。接着用手的三个指头拿住材料，并使其稍突出在手指之上，右手持刀，切前先将材料和刀口蘸上些水（润滑），切去材料上端不整齐一段，刀身放平，由左前向右后方（即向着自己迅速拉切，切时手臂用力才能平稳）拉切。最后选取厚薄均匀的材料，用毛笔取出放在在玻片上制成临时玻片。

ii. 装片法：装片法是将新鲜、少量的生物材料直接放在载玻片的水滴

中，再盖上盖玻片，做成玻片标本的方法。其制作过程：擦净载玻片和盖玻片，将载玻片持平或放在平台上，用滴管吸水或其他液体滴一滴在在玻片中央（量要适度，以恰好被盖玻片盖满为度），将材料用解剖针或镊子平展于载玻片的液滴中，加盖玻片（为避免气泡产生，先将盖玻片一侧接触液体边缘，在慢慢向下落，放平盖玻片），制成玻片标本。

iii.

涂片法：涂片法是将材料均匀涂布在载玻片上的一种制片方法。其

iv. 制作过程：取洁净的载玻片，将涂抹的液滴滴于载玻片的中央或偏右约1／4处，左手持载玻片或放在平台上，右手持另一载玻片作推片。先慢慢向右移动，让短边接触溶液，两载玻片的夹角约为30－45度，再向左迅速推载玻片，即可涂成一均匀的薄片。也可用解剖针、牙签、火柴杆等涂成薄片，盖上盖玻片即可。 压片法：压片法是将生物材料置于载玻片和盖玻片之间，施加一定

压力，将组织压散的一种方法。其制作过程：取洁净的载玻片，先将解离好的或疏松的材料放在载玻片中央，加一滴清水或染液，再进行压片，压片时，可用针尖或刀尖直接轻压材料，或把盖玻片盖上，用刀柄或手指轻压盖片，或盖玻片上再加一片载玻片，用手指轻压载玻片，压片时应注意不能移动盖玻片。

七、 注意事项

a) 装片细胞密度。

b) 涂片时的加液量。

c) Giemsa染液染色时防止在玻片表面形成氧化膜。方法一：扣染，带水冲

洗；方法二：在载玻片染色盒内染，先插玻片，后加染液，带水冲洗。