如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子

如何正确设计从生物样品中分离纯化生物 大分子

一、什么是生物大分子？ 众所周知，机体是由数以亿万计分子量大小不等 的分子组成。参与集体构成并发挥重要生理功能 的生物大分子通常都有一定的分子结构规律，都 是由一定的基本结构单位，按一定的排列顺序和 连接方式而形成的多聚体。

蛋白质、核酸和多糖是3类主要的生物大分子。

二、生物大分子分离纯化的特殊性 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种 乃至几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微， 分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境 时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种 组成的综合影响，很难准确估计和判断。

三、通用的技术路线1.前期准备 2.生物材料的选择及预处理

3.组织与细胞破碎4.初级提取分离

5.精细分离纯化6.纯度鉴定 7.产物处理

1.前期准备a、确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求 不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探 索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。本课题要求对生物大分 子进行分离提纯，也即在了解生物大分子(即蛋白质、核酸、脂质、糖类) 的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。 b、了解的生物大分子的物学性质

1)在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2)在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性 3)固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4)各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在 电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配 系数 5)其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化 学试剂的稳定性。 6)对其他生物分子的特殊亲和力。

2.生物材料的选择及预处理制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料 的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成 本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后 在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要 先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需 深度冷冻保存。

3.组织与细胞破碎不同的生

物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易 不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎， 植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要 采取专门的细胞破碎方法。

(1)机械法：研磨、组织捣碎器

(2)物理法：1) 反复冻融法 2) 超声波处理法 3) 压榨法 4) 冷热交替法 3)

(3)化学与生物化学方法：1) 自溶法 2) 溶胀法酶解法 4) 有机溶剂处理法

4.初级提取分离 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的 增加和保持其生物活性。

可分为水溶液提取和有机溶剂提取⑴ 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。 稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提 取蛋白质和酶最常用的溶剂。 ⑵ 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固或分子中非 极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀 碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。

5.精细分离纯化刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一 步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的不同特 性，选择不同方法。

电荷性质的差异：离子交换层析法 分子大小形状差异：凝胶过滤法 离心法 溶解度差异：沉淀法 分配层析 超滤法 萃取

电泳法 透析法

结晶

盐析 有机溶剂沉淀 选择性沉淀

6.纯度鉴定

电泳法由于混合物中各组分所带电荷性质、数量及分子 量不同，因此, 在同一电场的作用下，各组分泳 动的方向和速度各异，导致在一定时间内，各组 分移动距离的不同，从而使各组分得以被分离。

7.产物处理 浓缩、干燥经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需 要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而 浓缩、干燥。

保存保存应在低温避光环境下，有时还需加入防腐剂或稳定剂， 防止生物大分子变性失活。