医学分子生物学实验技术

2013年11月12日星期二

第一章 蛋白质的分离纯化 生命大分子物质的特点： 1、生命大分子是动物、植物和微生物在进 行新陈代谢时所产生的活性物质 2、生命大分子的特殊性和复杂性 3、生命大分子都是由简单的小分子构成的 物 4、具有特殊的结构和功能 5、生命大分子不稳定2013年11月12日星期二 2

材料的选择与处理 材料的选择 有效成分：欲纯化的某种单一的生命大分子 物质。相对于有效成分以外的物质称杂质。 组织、器官 动物 血液、分泌物 材 料 植物 根、茎、叶 来 源 微生物2013年11月12日星期二 3

选材原则： ①含有效成分丰富、稳定性好； ②来源丰富、保持新鲜； ③材料适合加工提取； ④具有经济利用价值。

研究对象的选择组织差异性 时间差异性 生理状态差异性2013年11月12日星期二 4

蛋白质在组织或细胞中一般都是以 复杂的混合形式存在，每种类型的 细胞都含有上千种不同的蛋白质。 蛋白质的分离(separation,isolation) 和纯化(purification)工作是生物化学 中一项艰巨而繁重的任务。

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蛋白质纯化的总目标是增加制品的 纯度(purity)或比活(specific activity), 以增加单位蛋白质重量中所要蛋白 质的含量或生物活性(比活常以活力 单位数/毫克蛋白质表示)。 分离纯化某一特定蛋白质的一般程 序可以分为前处理、粗分级分离和 细分级分离3步

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(1) 前处理 (pretreatment) 分离纯化某一蛋白质，首先要求把 蛋白质从原来的组织或细胞中以溶 解的状态释放出来，并保持原来的 天然状态，不丢失生物活性。 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪 组织。

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种子材料应先去壳甚至去种皮以免 受杂质的污染，油料种子最好先用 低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择适当的 方法，将组织和细胞破碎。

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机械破碎法

物理破碎法

捣碎法 研磨法 匀浆法 温度差破碎法 压力差破碎法 超声破碎法

化学破碎法 利用化学渗透的方法，通过有机 溶剂、抗生素、表面活性剂、金属熬合剂、变 性剂等，使细胞膜破碎的方法。 酶促破碎法 利用酶的活性破坏细胞膜的化学 结构使细胞膜破碎的方法。2013年11月12日星期二 9

如果所要的蛋白质主要集中在某一 细胞组分，如细胞核、染色体、核 糖体或可溶性的细胞质等，则可利 用差速离心方法将它们分开在不同离心力场下沉降的细胞器

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如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜 质细胞器结合的，则必须利用超声波 或去污剂使膜结构解聚，然后用适

当 的介质提取。

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(2) 粗分级分离 (rough fractionation) 当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获 得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与 其他杂蛋白分离开来。 一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有 机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、 处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐),又能 浓缩蛋白质溶液。 有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或 盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻 真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓 缩。2013年11月12日星期二 12

(3) 细分级分离 (fine fractionation)进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶 过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲 和层析等。必要时还可选择电泳法，包 括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯 化步骤。用于细分级分离的方法一般规 模较小，但分辨率很高。

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(4) 结晶 结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋 白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽 管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但 只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才 能形成结晶。 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋 白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断 定制品处于天然状态的有力指标。 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的， 结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态， 此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶 过程。2013年11月12日星期二 14

第二节 确立测定方法 寻找哪些生物材料中含有有效成分 监测有效成分提纯程度 吸收光谱 光谱法 荧光光谱 浊度分析 电化学法 生物活性检测法 免疫分析法2013年11月12日星期二 15

吸收光谱 根据有效成分的颜色、对紫外吸收能力进行 测定； 利用有效成分与生色基团所进行的特殊的呈 色反应进行测定。 荧光法：利用有效成分所进行的特殊的化学 反应并偶联NAD+或NADP+的还原反应产生 NADH或NADPH。还原型尼克酰胺发荧光。 也可利用NAD和NADP的光谱变化进行测定

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