草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性

于红梅，赵密珍，王　静，等．草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（１１）：１２４－１２７．

草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性

于红梅，赵密珍，王　静，孟宪风

（江苏省农业科学院园艺研究所，江苏南京２１００１４）

　　摘要：应用ＰＣＲ技术，结合形态学手段，对草莓枯萎病病原菌种类进行鉴定，从江苏省农业科学院草莓生产基地

采集草莓枯萎病株，对草莓枯萎病病原菌进行分离鉴定。在ＰＤＡ培养基上用单孢分离法培养出３个单菌系，用交叉显微镜初步鉴定该病原物为草莓枯萎病病原菌尖孢镰刀菌。以这３个菌系ＤＮＡ为模板，利用真菌通用引物ＩＴＳ１、ＩＴＳ４对单菌系进行ＰＣＲ扩增，获得５４４ｂｐ转录间隔区片段（ＩＴＳ），序列测定、Ｂｌａｓｔ搜索比对结果表明，３个单菌系序列完全一致，与番茄枯萎病病原菌的１８ＳｒＲＮＡ转录间隔区同源性达１００％，均属尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）。以ＰＤＡ为培养基，采用十字交叉法测定草莓枯萎病菌的生物学特性，结果表明：草莓枯萎病菌在１５～３５℃、ｐＨ值为４～８范围内均生长较好，最适温度为３０℃，ｐＨ值为５～８时菌落变化不明显。　　关键词：草莓枯萎病；生物学特性；分离；培养

０１２４－０３　　中图分类号：Ｓ４３６．６８　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１３）１１－

　　草莓（ＦｒａｇａｒｉａａｎａｎａｓｓａＤｕｃｈ．）属蔷薇科草莓属多年生

草本植物，果肉鲜美多汁，堪称“水果皇后”。草莓上市时间适逢鲜果匮乏期，且采摘持续时间长。近年来，草莓种植面积逐年增大，品种不断更新，频繁地调种、引种以及连作，导致草莓枯萎病蔓延。草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌草莓专化型（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．Ｆｒａｇａｒｉａｅ）从根部侵染引起的系统性病害，从苗期到收获期都会发生。草莓感染草莓枯萎病后，地上部分表现为心叶变黄绿、卷曲呈船形、两边不对称，叶片无光泽，叶柄及根部维管束变褐色或黑褐色，地下根系黑褐

［１］

色，不长新根。该病可导致草莓结果减少、果实无法正常

［２－３］

。目前已有关于利用形膨大、品质降低，甚至全株枯死

态学鉴定草莓枯萎病的报道。ＰＣＲ技术由于具有灵敏度高、准确、快速等优点，已被广泛应用于植物病理学诊断领［４－５］域。本研究应用ＰＣＲ技术，结合形态学手段，对草莓枯萎病病原菌种类进行了鉴定，旨在为草莓枯萎病抗病育种工作提供参考。１　材料与方法

１．１　材料

草莓枯萎病株于２０１０年８月采自江苏省农业科学院草莓繁苗基地。１．２　试剂

Ｔｒｉｓ－ＨＣｌＡＲ、ＥＤＴＡＡＲ、磷酸钠ＡＲ、ＮａＣｌＡＲ、ＣＴＡＢ、Ａｇａｒｏｓｅ、ＰＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ、Ａｍｐ、胰蛋白胨、酵母提取物、无水乙醇ＡＲ。１．３　仪器

Ｏｌｙｍｐｕｓ交叉显微镜、ＢｉｏｍｅｔｒａＰＣＲ仪、ＢｅｃｋｍａｎＸ－２２Ｒ

收稿日期：２０１３

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金［编号：ＣＸ（１２）３０１２］。作者简介：于红梅（１９７６—），女，江苏兴化人，硕士，助理研究员，主要从事草莓抗病育种研究。Ｔｅｌ：（０２５）８４３９０２１９；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｈｍｊｓｘｈ＠１６３．ｃｏｍ。

冷冻离心机、Ｔａｎｏｎ３５００凝胶成像系统、华利达ＺＤ－９５５６水

平摇床等。１．４　方法１．４．１　草莓枯萎病菌株的分离、纯化　采用常规分离法，将病株根用自来水冲洗干净并晾干，在无菌操作台用７５％乙醇消毒３０ｓ，０．１％ＨｇＣｌ２浸泡６０ｓ，无菌水换洗３次；取１ｃｍ长病株根在无菌水中纵切成４份，再次移入ＰＤＡ平板培养，用

［６］

连续稀释法经单孢分离纯化后获得供试菌株。ＰＤＡ培养基成分：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。　１．４．２　草莓枯萎菌菌丝、孢子形态　挑取纯化后菌株的边缘菌丝置于含ＰＤＡ的凹凸载玻片中，２５℃下置于灭菌培养皿中培养３ｄ，观察草莓枯萎菌菌丝、孢子形态。１．４．３　温度、ｐＨ值对菌丝生长及产孢的影响　用Ｎａ２ＨＰＯ４和柠檬酸，ＮａＯＨ和Ｎａ２Ｂ４Ｏ７配制ｐＨ值分别为４畅０、５．０、６．０、７．０、８．０的ＰＤＡ培养基，接种直径为５ｍｍ的菌饼，２８℃下培养，每处理重复３次，第５天测菌落直径，第１０天测产孢子量。将直径为５ｍｍ的菌饼接种到ＰＤＡ平板上，分别置于５、１０、１５、２０、２５、３０、３５℃等７个温度下培养，每处理重复３次，第３天测菌落直径。１．５　ＰＣＲ检测

［８－１０］

［７］

采用ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ扩增引物序列：ＩＴＳ１为５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′，ＩＴＳ４为５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′。ＰＣＲ反应体系：１．０μＬＤＮＡ模板，０．５μＬＴａｑ酶，２．０μＬ２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，２．５μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ，２．５μＬ２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，引物各１．０μＬ，加双蒸水至总体积为２５μＬ。反应程序为：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５１℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３４个循环；７２℃１０ｍｉｎ。１．６　ＰＣＲ产物的回收、克隆与测序

将ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分离，用ＤＮＡ回收试剂盒回收ＤＮＡ目的片段，将目的片段纯化克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体（Ｔａｋａｒａ公司），转化大肠埃希菌ＪＭ１０９感受态后，用

ＬＢ琼脂平板培养，挑取单个白色菌落于ＬＢ培养基摇菌过夜，取１．０ｍＬ菌液测序（上海生工生物工程有限公司）。测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ中进行搜索、比对，采用Ｃｌｕｓｔａｌｘ（默认程序）及ＧｅｎｅＤｏｃ软件进行多序列比对及输出，确定菌株类型。

２　结果与分析

２．１　草莓枯萎病的分离及形态学鉴定２．１．１　培养性状　样品常规分离后得到３株菌落，在ＰＤＡ培养基上２５℃下培养５～７ｄ后，菌落呈圆形，边缘白色，向

内逐渐变成粉红色或紫红色或白色（图１），表现出典型的草

［１１］

莓枯萎病病菌菌落症状。２．１．２　菌丝、孢子形态　菌丝蓬松有隔，大型分生孢子镰刀形，无色，弯曲，２～５个隔膜，多数为３个隔膜，平均大小为（１９～４５）μｍ×（２．５～５）μｍ，基部具足细胞；小型分生孢子椭圆形或卵形，无色，单孢或双孢，大小为（５～２６）μｍ×（２～４．５）μｍ，厚垣孢子球形，多数单孢子，平滑或皱缩，顶生或间

［１２］

生（图２），与相关报道一致

。

２．１．３　温度、ｐＨ值对菌丝生长及产孢的影响　由图３、图４可知，草莓枯萎病菌菌落在１５～３５℃、ｐＨ值为４～８范围内均可较好生长，最适温度为３０℃；ｐＨ值为５～８时菌落变化不明显，当ｐＨ值低于４时菌丝生长不良且产孢量少，说明尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）适合偏碱性条件，菌丝生长与产孢量不呈正相关。２．２　草莓枯萎病ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列的扩增及序列比较２．２．１　病菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列的扩增　以菌株ＤＮＡ为模板，利用ＩＴＳ１、ＩＴＳ４通用引物分别扩增３个菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列，其片段大小为５４４ｂｐ，产物电泳图有明亮条带，与预期大小一致（图

５）。

２．２．２　病菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列的比较　用Ｂｌａｓｔ２软件对３个菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列进行比对，结果表明，３个菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列一致，通过Ｂｌａｓｔ比对分析，发现３个菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列与尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．

［１３］

Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）相似度达１００％（图

６）。根据草莓枯萎病田间

症状、病菌的菌落形态特征以及ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列比对分析结果，可判断本试验分离的草莓枯萎病３个病原菌菌株皆为尖孢镰刀菌。

３　结论与讨论

了解草莓枯萎病病原菌的生物学特性是深入研究草莓枯萎病的基础，本研究结果表明，草莓枯萎病菌落在１５～３５℃、ｐＨ值为４～８范围内均可较好生长，最适温度为３０℃、ｐＨ值为５～８时菌落变化不明显，ｐＨ值低于４时菌丝生长不良且产孢量少，说明尖孢镰刀菌适合偏碱性条件且菌丝生长与产孢量不呈正相关。夏季草莓育苗困难与持续高温多雨有关，高温多雨的天气适合草莓枯萎病菌的生长。本试验建立的ＰＣＲ鉴定技术可准确判断植株病害是否为枯萎病。黄萎病、枯萎病都是系统性病害，黄萎病病菌属轮枝菌属，植株感染该病菌后外围老叶的叶缘、叶脉间变黄呈西瓜斑纹，心叶不畸形

［１４］

黄化，下部叶片最后变成青枯状直至植株枯死。传统方式分类鉴定镰孢菌是一项十分复杂的工作，主要通过形态特征、生理生化指标来分类鉴定该病原真菌。该方法受外界多种因素影响，不确定性很大，培养物不典型或不产孢子，使得鉴定工作更困难，因此有必要建立快速鉴定草莓枯萎病的方法。

应用ＰＣＲ扩增技术检测草莓枯萎病具有快速、准确、方便等优点，但ＰＣＲ反应条件需要仔细优化，本试验退火温度为５８℃时没有目的条带，当退火温度为５１℃时出现明亮单一的条带。ＰＣＲ扩增技术已被普遍用于真菌鉴定

［１５－１６］

。植物真菌

因不同地理分布、不同寄生宿主呈现多样性、复杂性，ＰＣＲ技

术在真菌鉴定上存在很大困难。为了更好地了解草莓枯萎病病原菌之间的分化与差异，不仅要增加不同地区的菌株，还要做寄主转化试验，同时有必要对其基因序列进行测序分析。

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江　曙，段金廒，钱大玮，等．腐烂茎线虫侵染机理及其防治技术体系的研究思路与方法［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（１１）：１２７－１３０．

腐烂茎线虫侵染机理及其防治技术体系的

研究思路与方法

江　曙，段金廒，钱大玮，杨念云，严　辉

（南京中医药大学，江苏南京２１００４６）

　　摘要：腐烂茎线虫主要侵染甘薯、马铃薯等农作物以及当归、薄荷等多种中药材，造成农产品及中药材大量减产、品质低劣，该线虫病害是一种毁灭性病害，已被我国列入检疫性病害。综述了腐烂茎线虫的生物学特性、传播途径及侵染机理，从化学防治、无病壮苗、轮作覆膜等农艺措施，尤其是培育和使用抗病良种及生物防治等方面，提出了防治腐烂茎线虫危害的技术体系。

　　关键词：腐烂茎线虫；侵染；防治技术体系；思路；方法

　　中图分类号：Ｓ４３２．４５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１３）１１－０１２７－０４

＋

　　腐烂茎线虫（ＤｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒＴｈｏｒｎｅ）属线虫纲垫习目茎线虫属，最初是在马铃薯上发现的，导致马铃薯腐烂，因此在国外也有“Ｐｏｔａｔｏｒｏｔｎｅｍａｔｏｄｅ”之称。这种线虫在中国首先发现于甘薯，主要侵染块根使其腐烂，引起甘薯茎线虫病。腐烂茎线虫主要分布于美国、加拿大、秘鲁、伊朗、巴基斯坦、日本、新西兰、南非和许多欧洲国家，也是我国进境植物检疫性线虫，主要分布于我国河南、山东、河北、北京等地。一些农作物及中药材被侵染后，在生长后期和贮藏期可表现出如下３种症状类型：一种是形成“糠心病”，病部由上而下、由内向外扩展，被线虫危害后形成不规则的孔洞，加之其他微生物的侵染，受害部位呈现褐白相间的干腐症状，外表正常，但重量变轻。另一种症状是土壤中腐烂茎线虫经植物外皮侵入形成“糠皮病”，病部一般由下向上、由外向内扩展，在表皮产生青色至紫色稍凹陷小斑，然后因其他微生物侵染呈现黑褐色，后

收稿日期：２０１３－０４－２４

基金项目：国家自然科学基金（编号：８１０７２９９６）；国家科技支撑计划（编号：２００６ＢＡＩ０９Ｂ０５－１、２００７ＢＡ１３７Ｂ０２）。

作者简介：江　曙（１９７０—），男，安徽安庆人，博士，副教授，主要从事微生物与药用植物品质的相关研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｓｈｕ２０００＠１６３．ｃｏｍ。

期表皮龟裂，皮层内部呈褐白相间的干腐症状。此外，糠心和

［１］

糠皮可同时发生，互为转换，混合发展。线虫侵染农作物及中药材后，不仅田间危害直接造成减产，而且还能造成贮藏期烂窖、育苗期烂床、移栽后死苗，有的死苗１５％～４０％，发

［２］

病重者甚至高达６０％～７０％，造成严重减产。因此，本文通过探讨腐烂茎线虫的侵染机理，建立有效可行的防治技术体系，以促进农作物及中药材产量和品质的提高。１　腐烂茎线虫的生物学特性

腐烂茎线虫是一种杂食性的植物寄生线虫，寄主范围较广，包括７０余种作物和杂草，也可以寄生在土壤真菌的菌丝上，主要寄主是马铃薯，其他常见寄主有鸢尾、郁金香、大菖蒲、甜菜、三叶草、大丽菊、胡萝卜、花生、向日葵、甘薯、大豆、

［３－４］

番茄、烟草、甘蔗、大麦、小麦等及多种野生植物。在无高等植物的情况下，该线虫能够在约４０属７０种真菌上繁殖，常见的有Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｈｏｍａ、Ｔｒｉ－ｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ。不同寄主上的线虫群体在致病力上有差异，水仙、鸢尾、风信子上的线虫分离物在马铃薯上的致病性表现出明显的差异，其中从风信子上分离到的线虫不能侵染马铃薯。在我国，腐烂茎线虫主要危害甘薯，

４１－４３．　

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草莓枯萎病菌的分离、鉴定及生物学特性

作者：作者单位：刊名：

于红梅， 赵密珍， 王静， 孟宪风

江苏省农业科学院园艺研究所,江苏南京,210014江苏农业科学

Jiangsu Agricultural Sciences

2013(11)

英文刊名：

年，卷(期)：

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