功能性抗氧化肽制备与机制研究进展(2)

372天然产物研究与开发 Vol 20

自氧化反应7d后,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解物对亚油酸过氧化抑制率分别为54%和45%,而其它

酶解物抑制率都低于这两种酶。以猪骨胶原蛋白为底物,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解物自由基清除率分别为53.67%和83.22%,后者性价比高于前

[13]

者,更适合水解猪骨明胶获得抗氧化肽。Pe a Ramos等

[14]

2.1 疏水性氨基酸

在多不饱和脂肪酸分子中,双键减弱了与之连接的碳原子与氢原子之间的碳氢键,使与两个双键相连的亚甲基上的氢易被自由基抽去,引发脂质过氧化链式反应。

LH+OH L+H2O

L+O2 LOO

用三种纯酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰

凝乳蛋白酶)和三种粗酶(Alcalase、Protamex、Fla vourzyme)水解大豆蛋白,所得酶解物抗氧化性差异

大,如90 预处理底物,胰凝乳蛋白酶和Fla vourzyme水解0.5h所得产物抗氧化性高,分别使脂质过氧化降低65%和60%,而不管是否预处理,木瓜蛋白酶酶解物均无活性。这种差异的原因可能是:各种酶解反应条件各异,影响底物蛋白构象变化;不同酶专一性不同,水解同一底物所得产物不纯,所含抗氧化肽结构、氨基酸组成及序列都有差异,这些都是影响肽功能性质的主要因素(表1)。1.3 水解度

水解产物的抗氧化性与产物中肽含量及其分子量(或肽链长度)大小有明显相关性。Wu等报道ProteaseN水解鲭鱼蛋白所得水解产物抗氧化性与肽含量变化趋势相同,前10h迅速增加,之后逐渐降低,并且1400Da肽的抗氧化性比200和900Da肽强。可能随着水解反应进行,水解度逐渐增大,底物蛋白逐渐被水解为游离氨基酸。所以,在抗氧化肽生产制备中,控制水解度尤为重要。而选用的底物、酶及水解条件不同,制备抗氧化肽所需水解度也不同(表1)。1.4 抗氧化肽的分离纯化

抗氧化肽氨基酸残基数多小于20,分子量均较小,酶解产物成分复杂且分子量非常接近,难以分离纯化。主要分离纯化方法有超滤(UF)、尺寸排阻层析(SEC)、离子交换层析(IEC)、快速蛋白质液相层析(FPLC)、高效液相色谱(HPLC)和RP HPLC,质谱(MS)和Q TOF电喷雾离子质谱等(表1),这些方法已成功的用于金枪鱼骨架蛋白酶解物、脱卵磷脂卵黄酶解物和阿拉斯加青鳕皮明胶酶解物中抗氧

[16 18]

化肽的纯化。

[15]

LOO+LH LOOH+L

该反应导致脂质分子不断消耗和脂质过氧化物

如LOOH等大量形成。疏水性丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸的非极性脂肪烃侧链能够加强抗氧化肽与疏水性多不饱和脂肪酸互作,含疏水性氨基酸肽通过与氧结合或抑制脂质中氢的释放,延缓脂质过氧化链反应,从而保护脂质体系、膜质完整性,起到抗氧化作用。如Chen等

[4]

从大豆蛋白酶解物中纯化到6

[19]

个抗氧化肽,N 端都含疏水性氨基酸;Mendis等从鱼皮明胶中分离到高疏水性抗氧化肽HGPLGPL;Kim等

[20]

从巨大乌贼肌肉中提取出两个富含疏水

性甘氨酸、亮氨酸和丙氨酸的抗氧化肽(分子量分别为1307和747Da),发现GL在两个肽中出现频率较高,推测与抗氧化性有关,GL是否为抗氧化肽保守序列值得深入研究,而且,在清除脂质自由基实验中,747Da肽活性更强,可能小分子量更能促进肽与脂质互作。2.2 抗氧化性氨基酸

许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力,如半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸等。已知游

2++

离金属离子,如:Fe、Cu等,可催化H2O2产生极活泼的OH,含组氨酸肽能通过螯合这些过渡金属起到抗氧化作用,组氨酸上有 氨基、羧基和活性侧链基团咪唑基, 氨基和羧基与金属离子可形成五元环, 氨基和咪唑基与金属离子可形成六元环,羧基和咪唑基与金属离子可形成七元环。Chen、Kim和Park等都分离到含组氨酸抗氧化肽,并指出其抗氧化活性与螯合金属离子有关。 具供氢能力的氨基酸如色氨酸和酪氨酸将氢原子给予自由基后,自身形成的自由基中间体苯氧自由基和吲哚自由基借助共振求得稳定,导致自由基链反应减慢或终止。有研究者还提出与质子供体酪氨酸邻近的天冬氨酸和谷氨酸的羧酸根具吸电子作用,使酪氨酸酚羟基上氧电子云密度减弱,更有利于质子释放,增强了酪氨酸质子供体效应,而且,由于

[12]

[17]

[4]

2 抗氧化肽的抗氧化机制

迄今关于抗氧化肽作用机制研究多集中于与抗氧化肽活性密切关联的三类氨基酸(即疏水性氨基