CRISPR_Cas9介导的基因组定点编辑技术_方锐

Reviews and Monographs 综述与专论

生物化学与生物物理进展

Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(8): 691~702

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CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术 *

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方 锐 畅 飞 孙照霖 李 宁 孟庆勇

(中国农业大学农业生物技术国家重点，北京 100193)

摘要 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统成功被改造为第三代人

工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑．目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的 基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点 InDel 突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失．由于其突变效率 高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具．本文从 CRISPR/Cas 的研究历 史、分类、作用机理以及基因定点修饰应用等方面进行简单介绍，希望能够为在这一领域的科研工作者提供参考．

关键词 人工核酸内切酶，基因编辑 ，CRISPR，基因打靶，CRISPR/Cas 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2013.00215

基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之 一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类 技术成为现代分子生物学的研究热点．早期仅基于 同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限 制．直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease， EEN)出现，将这一现状彻底改变．

锌 指 核 酸 内 切 酶 (zinc finger endonuclease， ZFN)是第一代人工核酸内切酶．锌指是一类能够 结合 DNA 的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约 有一半含有锌指结构，ZFN 是将锌指蛋白与核酸 内切酶 FokⅠ融合形成的核酸内切酶[1]，利用它可 以在各种复杂基因组的特定位置制造 DNA 的双链 切口． 到目前为止，ZFN 已经成功应用于黑长尾 猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海 胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类 iPS 细胞[2]．更令人振奋的是已经有用于治疗 HIV 的 ZFN(破坏人 CCR 基因表达)药物进入二期临床 试验[3]．但是，ZFN 制备复杂，成本昂贵，而且其 技术专利被少数几家商业公司控制．很快，第二代 人工核酸酶—类转录激活因子效应物核酸酶

(transcription activator-like effector nuclease， TALEN) 的出现在很大程度上替代了 ZFN．2009 年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码

的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector，TALE)与 DNA 的碱基对应关系解密[4-6]

． 2010 年，首次报道 TALEN 蛋白在酵母中应用成 功[7]，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、 猪、牛中得到迅速的应用[8]．TALEN 可以和 ZFN 一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建 较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的 青睐．2012 年，TALEN 被 《科学》(Science)杂志评 为十大科学突破之一[9]．无论是 ZFN 还是 TALEN， 这两种人工核酸酶的原理是一样的，都是由 DNA 结合蛋白与核酸内切酶 FokⅠ融合而成． 2013 年

初，一种全新的人工核酸内切酶 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated(Cas)9 出现，它主要是基于细菌 的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简 单、成本低、作用高效[10]．本文主要从 CRISPR 研 究历史、作用机理以及 CRISPR/Cas 在定点修饰中 的应用等方面介绍 CRISPR/Cas9 的研究进展．

* 现代农业产业技术体系建设专项资助项目 (CARS-37). ** 通讯联系人.

Tel: 010-62731142, E-mail: qingyong.meng@http:// 收稿日期：2013-05-19，接受日期：2013-07-29

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生物化学与生物物理进展

Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40 (8)

1 CRISPR/Cas 的基因座结构

CRISPR/Cas 的基因座结构相对简单(图 1)．以 产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370) 的典型 TypeⅡ CRISPR/Cas 为例，其基因座结构可分别三

tracrRNA 5'

部分，5' 端为 tracrRNA 基因，中间为一系列 Cas

蛋 白 编 码 基 因 ， 包 括 Cas9、 Cas1、 Cas2 和 Csn2，3' 端为 CRISPR 基因座，由启动子区域和众 多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺 序排列组成．

Cas9 Cas1 Cas2Csn2 引导序列 CRISPR

3'

正向重复序列

tracrRNA

间隔序列 Pre-crRNA

Cas9

RNaseⅢ

入侵的病毒或质粒 DNA

PAM

Fig. 1 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double-strand break

图 1 产脓链球菌 CRISPR/Cas9 干扰噬菌体或外源质粒入侵示意图

TracrRNA、RNaseⅢ和 Cas9 介导前体 pre-RNA 成熟；TracrRNA、crRNA 和 Cas9 形成的核糖核蛋白复合物介导外源遗传物质切割．

2 CRISPR 研究历史

1987 年，日本课题组在 K12 大肠杆菌的碱性 磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列[11]，随后的 研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细 菌的基因组中，2002 年，科学家将其正式命名为 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)[12-14]．因为缺乏病毒和质粒的序列

信息，初期对 CRISPR 的研究进展缓慢，其行使的 确切功能一直未能阐明．2005 年，三个研究小组 均发现 CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染 色体外 …… 此处隐藏：30251字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……