实验六哺乳动物基因组DNA的提取

哺乳动物基因组DNA的提取

实验六 哺乳动物基因组DNA的 哺乳动物基因组DNA DNA的 提取及琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取及琼脂糖凝胶电泳检测DNA

6学时

哺乳动物基因组DNA的提取

实验目的:学习和掌握用酚-氯仿抽提法 实验目的:学习和掌握用酚提取哺乳动物的基因组DNA的方法. 提取哺乳动物的基因组DNA的方法. DNA的方法

实验原理:真核生物DNA提取的材料来源 实验原理:真核生物DNA DNA提取的材料来源可以是培养的细胞,血液, 可以是培养的细胞,血液,肝,脾,肾等 组织,通常的方法是在有EDTA SDS等去污 EDTA和 组织,通常的方法是在有EDTA和SDS等去污 剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚 剂存在下,用蛋白酶K消化细胞, 氯仿/异戊醇抽提, /氯仿/异戊醇抽提,可能得到哺乳动物基 因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100DNA DNA长度为100 150kb. 150kb.

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观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化 DNA 乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA DNA堆积碱基之间的 乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的 一个三环平面基团.它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性. DNA的结合几乎没有碱基序列特异性 一个三环平面基团.它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性. 在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5 2.5个碱基插入一个溴化乙 在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙 锭分子.当染料分子插入后, 锭分子.当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并 通过范德华力与上下碱基相互作用. 通过范德华力与上下碱基相互作用.这个基团的固定位置及其 与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光, DNA结合的染料呈现荧光 与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产 率比游离溶液中染料有所增加. 率比游离溶液中染料有所增加. DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料 吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料, DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染 料本身吸收302nm 366nm的光辐射 这两种情况下, 302nm和 的光辐射. 料本身吸收302nm和366nm的光辐射.这两种情况下,被吸收的 能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来. 590nm处重新发射出来 能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来.由于溴化乙锭 DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍 复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20 -DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所 以当凝胶中含有游离的溴化乙锭(0.5ug/ml)时,可以检测到 以当凝胶中含有游离的溴化乙锭(0.5ug/ml) 少至10ng DNA条带 10ng的 条带. 少至10ng的DNA条带.

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实验材料与试剂: 实验材料与试剂: 材料:家兔的全血 材料: 器材:移液器,高速冷冻离心机, 器材:移液器,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅等. 台式离心机,水浴锅等.

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试剂: 试剂: 1,提取DNA所需的试剂配制 提取DNA所需的试剂配制 DNATrisCl Cl( 8.0) 1 M Tris Cl(pH 8.0) EDTA( 8.0) 0.5M EDTA(pH 8.0) 10% SDS STE 氯仿:异戊醇(24:1) 氯仿:异戊醇(24:1) 3M无水NaAc(pH5.2) 无水NaAc 3M无水NaAc(pH5.2) TE缓冲液 pH8.0) 缓冲液( TE缓冲液(pH8.0) 抗凝剂ACD 抗凝剂ACD PBS 0.5M NaCl mg/ml蛋白酶 蛋白酶K 20 mg/ml蛋白酶K 氯仿(1:1) 酚:氯仿(1:1) 冰乙醇

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2,琼脂糖电泳所用的有关试剂10×TBE缓冲液, 10×TBE缓冲液, 缓冲液 1.2%琼脂糖 琼脂糖, 1.2%琼脂糖, 琼脂糖凝胶加样缓冲液, 琼脂糖凝胶加样缓冲液, 10mg/ml溴化乙锭 EB). 溴化乙锭( 10mg/ml溴化乙锭(EB).

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实验步骤1,基因组DNA的提取 ,基因组DNA的提取 DNA将冰冻的家兔血液在室温下溶化; 将冰冻的家兔血液在室温下溶化; 0.6ml血液转入一无菌的1.5ml离心管中 血液转入一无菌的1.5ml离心管中, 取0.6ml血液转入一无菌的1.5ml离心管中,加入等体积 PBS磷酸盐缓冲液 充分混匀后12000rpm离心5min 磷酸盐缓冲液, 12000rpm离心5min, 的PBS磷酸盐缓冲液,充分混匀后12000rpm离心5min, 弃上清; 弃上清; 加入400l STE,14l的20%的SDS,37℃水浴 ; 加入 , 的 的 , ℃水浴1h; 的蛋白酶K混匀 加8l的20mg/ml的蛋白酶 混匀,55℃水浴消化过夜 的 的蛋白酶 混匀, ℃ (10~14h); ~ ); 将消化的样品加入等体积的Tris饱和酚,充分摇匀, 饱和酚,充分摇匀, 将消化的样品加入等体积的 饱和酚 12000rpm离心 离心10min; 离心 ;

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将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中; 将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中;再加入等体 1.5ml离心管中 积的Tris饱和酚,充分摇匀,12000rpm离心10min; Tris饱和酚 离心10min 积的Tris饱和酚,充分摇匀,12000rpm离心10min; 将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中; 将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中;并加入等体 1.5ml离心管中 积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1), ),旋涡振荡至充 积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),旋涡振荡至充 分混匀,12000rpm离心10min; 离心10min 分混匀,12000rpm离心10min; 将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中; 将上层水相转入另一无菌1.5ml离心管中;并加入等体 1.5ml离心管中 积的氯仿:异戊醇(24:1),充分振荡混匀, ),充分振荡混匀 积的氯仿:异戊醇(24:1),充分振荡混匀, 12000rpm离心10min; 12000rpm离心10min; 离心10min 将上清液转移到另一无菌1.5ml离心管中;加入2 将上清液转移到另一无菌1.5ml离心管中;加入2倍体积 1.5ml离心管中 的冰乙醇,1/10体积醋酸钠水平摇动 体积醋酸钠水平摇动, 的冰乙醇,1/10体积醋酸钠水平摇动,直到可见絮状 DNA析出 析出; DNA析出;

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将样品

置-20℃冰箱冷冻30min或冰浴15~20min, 将样品置-20℃冰箱冷冻30min或冰浴15~20min, 冰箱冷冻30min或冰浴15 取出后再次12000rpm离心10min 12000rpm离心10min, DNA沉淀 沉淀; 取出后再次12000rpm离心10min,使DNA沉淀; 用枪头将DNA挑到另一无菌离心管中, 用枪头将DNA挑到另一无菌离心管中,用适量的 DNA挑到另一无菌离心管中 70%乙醇洗涤并晃动 以洗出DNA的杂质; 乙醇洗涤并晃动, DNA的杂质 70%乙醇洗涤并晃动,以洗出DNA的杂质; 倒出乙醇,将DNA用真空干燥或自然晾干,加入适 倒出乙醇, DNA用真空干燥或自然晾干, 用真空干燥或自然晾干 量的TE缓冲液回溶, 20℃保存备用 TE缓冲液回溶 保存备用. 量的TE缓冲液回溶,-20℃保存备用.

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基因组DNA的检测 基因组DNA的检测DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳 样品在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳, 取3μl DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳,在紫 外灯下观察电泳结果,检测基因组DNA的完整性. DNA的完整性 外灯下观察电泳结果,检测基因组DNA的完整性. 称取适量的琼脂糖,加入到盛有100ml 0.5×TBE的烧 称取适量的琼脂糖,加入到盛有100ml 0.5×TBE的烧 杯中,在微波炉上加热至融化,室温放置; 杯中,在微波炉上加热至融化,室温放置; 当温度降为约60℃时将胶倒入胶托中, 60℃时将胶倒入胶托中 当温度降为约60℃时将胶倒入胶托中,根据需要插入 适当宽度的梳子,制成适当厚度的凝胶; 适当宽度的梳子,制成适当厚度的凝胶; 待凝胶凝固后将梳子拔出,将凝胶放入电泳槽中, 待凝胶凝固后将梳子拔出,将凝胶放入电泳槽中,向 槽中加入0.5 TBE电泳缓冲液 液面没过点样孔; 0.5× 电泳缓冲液, 槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液,液面没过点样孔; 将提取的基因组DNA样品与上样缓冲液按5:1 DNA样品与上样缓冲液按5:1的比例混 将提取的基因组DNA样品与上样缓冲液按5:1的比例混 合均匀,加入点样孔,70V电压电泳1h; 电压电泳1h 合均匀,加入点样孔,70V电压电泳1h; 电泳结束后将凝胶放入10mg/ml EB溶液中 染色20min 溶液中, 20min, 电泳结束后将凝胶放入10mg/ml EB溶液中,染色20min, 紫外灯下观察电泳结果. 紫外灯下观察电泳结果.

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注意事项EB(溴化乙锭),酚为剧毒,在操作有毒试剂, EB(溴化乙锭),酚为剧毒,在操作有毒试剂,必 ),酚为剧毒 须戴上PE手套,小心操作,防止进入人体. PE手套 须戴上PE手套,小心操作,防止进入人体. EB处理:(1 固体溴化乙锭在262℃分解, EB处理:(1)固体溴化乙锭在262℃分解,在标准 处理:( 262℃分解 条件进行焚化后不可能再有危害性;( ;(2 EB溶液中 条件进行焚化后不可能再有危害性;(2)EB溶液中 加入足量的水使EB的浓度降到0.5ml/ml以下, EB的浓度降到0.5ml/ml以下 加入足量的水使EB的浓度降到0.5ml/ml以下,再加 倍体积

的0.5mol/l高锰酸钾,小心混匀后再加1 0.5mol/l高锰酸钾 入1倍体积的0.5mol/l高锰酸钾,小心混匀后再加1 倍体积的2.5mol/L盐酸,小心混匀, 2.5mol/L盐酸 倍体积的2.5mol/L盐酸,小心混匀,于室温放置数 小时,然后加入1倍体积的2.5mol/L氢氧化钠, 2.5mol/L氢氧化钠 小时,然后加入1倍体积的2.5mol/L氢氧化钠,小心 混匀后可丢弃该溶液. 混匀后可丢弃该溶液.