AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

第 24 卷 第 7 期2009 年 7 月现 代 渔 业 信 息

MODERN FISHERIES INFORMATIONVol.24 No.7Jul., 2009

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

姚红伟 袁霞 付鑫

（大连水产学院生命科学与技术学院）

中国大连市黑石礁街52号 邮编：116023

景娜娜

（山西师范大学）

中国山西省临汾市贡院街1号 邮编：041004

【提要】 AFLP分子标记技术是DNA指纹技术的重大突破，由于其快速、简便、有效，因而在医学、农业、林业、畜牧业、渔业等领域中得到了广泛的应用。近年来人们不断地将这一技术完善和发展，使得AFLP成为迄今为止最有效的分子标记。本文简述了AFLP技术的基本原理、技术流程以及在水产动物中的应用情况。

姚红伟等，2009。AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用，《现代渔业信息》杂志，24（7）：22-24。

关键词：AFLP 水产动物 应用

扩增长度片段多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子该方法是继RFLP、标记方法，1993年获欧洲专利局专利，SSR和RAPD之后发展最快的DNA指纹技术，它结合了RFLP的可靠性和严格的PCR退火条件，有高度特异性，既克服了RFLP技术中Southern杂交的烦琐和耗时的缺点，又解决了RAPD等技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题。

［1］

提取方法有所不同。在提取过程中要特别注意避免基因组DNA的降解和其它物质的污染。

2.2 双酶切及连接

限制性内切酶的选择对AFLP分析的准确度具有关键性作用，其选择要根据分析对象的种类和所要达到的分辨度决定。可以采用单酶切，也可以双酶切或三酶切［3］，但一般多采用双酶切。双酶切的其中一种是稀有切点酶（Rare cutter），识别位点通常为6个碱基，如EcoR I、HindⅢ、PstI、Sac I、ApaI；另一种是多切点酶（Frequent cutter），识别位点通常为4个碱基，如Mse I和Taq I［4］。目前较为常用的两种酶仍是EcoRI和Mse I，基因组DNA用EcoRI和MseI双酶切可产生三种酶切片段：MseI-MseI、MseI-EcoRI、EcoRI-。EcoRI片段，实验证实扩增产物主要是EcoRI-MseI片段［5］

酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用下与两种内切酶相应的特定接头相连接，形成带接头的特异性片段。接头（Adaptor）一般是长度为14~18个核苷酸的人工合成的DNA双链，由两部分组成，一部分是核心序列（Core sequence），一部分是酶特定序列（Enzyme-specific sequence），能与酶切片段粘端互补。常用的多为EcoRI和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。

2.3 PCR预扩增

一般酶切片段要进行两次连续的PCR扩增，以提供大量的模板，并产生清晰、重复性高的扩增结果。第1次扩增为预扩增（Pre-amplification），AFLP扩增所用的引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列（Core sequence，CORE），限制性内切酶特定序列（Enzyme-specific sequence，ENZ）和3′端的带有选择性碱基的粘性末

［6］

端（Selective extension，EXT）。PCR预扩增的引物3′端具

1 AFLP基本原理

AFLP的基本原理是基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定的双链接头（Adaptor）连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列（Adaptor sequence）和PCR引物（Primer）3′末端的选择性碱基（Selective extension，ENT）的识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将特异的限制性片段分离开来，然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA指纹的多态性［2］。

2 AFLP技术流程

AFLP技术流程一般包括以下几步： 2.1 模板DNA的制备

在进行AFLP分析时，首先要提取高纯度的基因组DNA。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的

文稿收到日期：2009-05-29

作者简介：姚红伟（1981-），男，山西太原人，硕士研究生。研究方向：水产生物繁育。E-mail：yao_317@

有一个选择性碱基（EcoRI + A，MseI + C），通过预扩增对扩