真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

15 88

重庆医学 2 0 0 9年 7月第 3 8卷第 1 3期

论

著

真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl￣的构建和鉴定许铁峰。,汪良。,夏立平，陈兴。,阎瑾琦。,于继云。

( 1 .海南医学院肿瘤研究所附属医院肿瘤外科，海口5 7 0 1 0 2; 2 .苏州大学附属第一医院普通外科 2 3 5 3 0 0; 3 .军事医学科学院基础医学研究所疫苗工程研究室，北京 1 0 0 8 5 0 )摘要：目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素 p亚基 ( m a c a c a mu l a t t a c h o r i o n i c g o n a d o t r o p h i n p s u b u n i t, r mC G i￣ )基因真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl 3,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过 P C R扩增 r mC G￣的全段基因 c D NA,应用基

因工程技术将扩增的 c DNA克隆至 P GM— T e a s y,测序后插入 p c DN A3 . 1 (+)真核表达质粒，构建重组真核表达质粒 p c DNA 3 . 1(+)一 r mC Gl 3,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后，用脂质体转染技术转染 B 1 6细胞，通过 RT— P C R扩增出 B 1 6/ p c D NA3 . 1(+)一 r mC Gl 3细胞株中 r mC G l 3全段基因 c DN A。结果经 4轮 P C R,成功扩增出 r mC G￣ 3的 c D NA全长基因，酶切和测序证明正

确构建了真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl 3,通过 R T— P C R方法证实该质粒能在 B 1 6真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株 B 1 6/ p c D NA 3 . 1 (+)一 r mC G l 3。结论成功克隆和构建了 r mC G l￣的真核表达质粒栽体 p c DNA 3 . 1 (+)一 r mC Gl 3,为进一步研究 r mC G l 3的新功能和免疫治疗奠定了基础。

关键词：恒河猴绒毛膜促性腺激素 G亚基；质粒；真核表达；肿瘤疫苗中图分类号： R 7 3 0 . 2 1 文献标识码： A 文章编号： 1 6 7卜8 3 4 8 ( 2 0 0 9 ) 1 3— 1 5 8 8— 0 3

C o n s

t r u c t i o n a n d d e t e r mi n a t i o n o f a r e c o mb i n a n t e u k a r y o t i c p l a s mi d p c D N A 3 . 1 (+)一 r mC G[￥XU Ti e— fe n g …, WANG Li a n g, XI A Li~ pi n g, e t a 1 . ( 1 . C a n c e r I n s t i t u t e o f Ha i n a n Me d i c a l C o l l e g e, Aff i l i a t e d Ho s pi t a l o f Ha i n a n Me d i c a l Co l l e g e, Ha i k o u 5 7 0 1 0 2, C hi n a; 2 . Ge n e r a l S u r g e r y De p a r t me n t, Ti t e Fi r s t Af l i a t e d Ho s p i t a l o f Su z h o u Un i v e r s i t y, Su z h o u 2 3 5 3 0 0, Ch i n a;

3 . I n s t i t u t e o fB a s i c Me d i c a l R e s e a r c h V a c c i n e Wo r k s, Ac a d e my o fM i l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s, B e i j i n g 1 0 0 8 5 0, C h i n a ) Ab s t r a c t: O b j e c t i v e T o c o n s t r u c t a n e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi d e x p r e s s i n g ma c a c a mu l a t t a c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n h o r mo n e

p s u b u n i t ( r mC G[ 3 )g e n e a n d t e s t wh e t h e r t h e g e n e c o u l d b e e x p r e s s e d i n t h e c e l l B 1 6 i n v i t r o . Me t h o d s Th e f u l l— l e n g t h c D NA o fr mCGl 3 g e n e wa s o b t a i n e d b y P CR. Th e n t h e c DNA wa s i n s e r t e d i n t o t h e e u k a r

y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p c DNA3 . 1 (+) . Th e r e c o m—

b i n a n t e u k a r y o t i c p l a s mi d p c DNA 3 . 1 (+)一 r mC G l f wa s t r a n s f e c t e d i n t o e u k a r y o t i c c e l l B 1 6 b y L i p o f e c t i n . R T— P C R wa s u s e d t o c e r— t i f y wh e t h e r t h e g e n e wa s c o r r e c t l y e x p r e s s e d i n B 1 6/e D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣c e l 1 . R e s u l t s e D NA o f r mC G￣w a s c o r r e c t l y a mp l i— l f e d . T h e r e c o mb i n a n t e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi d p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G l f wa s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d, a n d i t c o u l d b e c o r r e c t l ye x p r e s s e d i n t h e B 1 6 c e i l s . C o n c l u s i o n Th i s r e c o mb i n a n t p l a s mi d p c DNA3 . 1 (+)一 r mCGI]wi l l p r o v i d e a b a s i s f o r f u r t h e r s t u d y o n

u n k n o w n f u n c t i o n s o f r mC G￣ . Ke y w o r d s: ma c a c a mu l a t t a c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n h o r m o n e 1 3 s u b u n i t ( r mC G￣ ); p l a s mi d; e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n; t u mo r v a c c i n e

人绒毛膜促性腺激素 B亚基 ( h u ma n c h o r i o n i c g o n a d o t r o— p h i n 8 s u b u n i t, h C G￣ )除了在正常的妊娠滋养层细胞中分泌

1 . 1 . 3试剂

与耗材

脂质体( L i p o f e c t a mi n e 2 0 0 0 Re a g e n t )购

自I n v i t r o g e n公司，低熔点琼脂糖和 D E P C购自 S i g ma公司，一

外，在许多恶性肿瘤细胞中也大量分泌，称为异位 h C Gl】]。异位h C G与恶性肿瘤的发生和发展的关系受到人们关注，以异位h C G为靶抗原的肿瘤疫苗也成为肿瘤生物治疗新的研究热点]。但 h C G I 3对人的免疫原性弱，在研究时不易观察结果，

步法 RT - P C R试剂盒、 T a q D NA聚合酶试剂盒、 D NA回收

试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自 Ta Ka R a公司， P GM- T e a s y

载体和 T D NA连接酶试剂盒购自 P r o me g a公司， G - 4 1 8购自G i b c o公司， Nh e I和 E c 0 R V限制性内切酶购自 NE wE N—

本组选用 r mC Gf l全长氨基酸编码序列的 e D NA来构建真核表达质粒 p c DN A3 . 1 (+)一 r mC G t 3,通过 R T - P C R检测出 B 1 6/ p c D NA3 . 1(+)一 r mC G￣细胞株中的该基因，为深入研究 r mC G l的生物学功能和以 r f m C G￣ t为靶点的免疫生物治疗奠定了基础。 1材料与方法 1 . 1材料

GL AND B i o L a b s公司， D ME M培养液、小牛血清购自黑龙江省同江市江海生物高新技术开发责任有限公司， L B培养基、双蒸水常规配置，其他生化试剂均为国产分析纯。

1 . 1 . 4仪器设备高速低温离心机 ( S I GMR 3 K1 8 ), D NA扩增仪( Ge n e Amp P C R S y s t e m2 4 0 0 ),恒压电泳仪 (北京六一仪器厂), C 0 2培养箱 ( Th e mo F o ma )。1 . 2方法

1 . 1 . 1质粒和宿主菌真核表达质粒 p c DNA 3 . 1 (+) ( I n—

1 . 2 . 1 目的基因的扩增根据 G e n e b a n k中 r mC G l 3 mR NA 的基因序列 ( AY O 1 1 0 1 5 )设计引物，并在其上游引物中加入限

v i t r o g e n )和大肠埃希杆菌 E . c o l i

J M1 0 9菌种为军事医学科学院三所六室保存。1 . 1 . 2细胞株六室保存。 黑色素瘤 B 1 6细胞为军事医学科学院三所

制性内切酶酶切位点 Nh e I和 k o z a k序列，在下游引物中加入限制性内切酶酶切位点 E c o R V,没有破坏 r mC G l f基因的阅读

框架结尾不加终止密码。全长序列共 5 1 7 b p,分两段均为

* 基金项目：国家高技术研究发展计划 ( 8 6 3 )资助项目( 2 0 0 1 AA2 1 7 1 3 1 ),海南省教育厅资助项目( Hj k j 2 0 0 6— 2 6 )。

重庆医学 2 0 0 9年 7月第 3 8卷第 1 3期 2 7 3 b p,重叠 2 9 b p;两大段各 2 7 3 b p可各按照 6段小引物设计， 每段 5 8 b p,重叠 1 5 b p。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，结果如下： 上端引物： 5 一31 P F1: TGC GGC CAC TGT GC C GCC CC A TCA ATG C CA CCC TGG C TG CCG AGA AGG AGG CCT GCC C1 PR 1: GCA GT A G CC GGC A CA GA T G GT GG T G TT G AC GG T GA T G CA CA C G GG GCA GGC CTC CTT C

1 58 9

向和反向序列测定。引物设计及测序由上海华诺公司完成。 1 . 2 . 3重组质粒转染 B 1 6细胞按文献[ 7]和 I n v i t r o g e n公司的 L i p o f e c t a mi n e 2 0 0 0 Re a g e n t说明书进行。将 B 1 6细胞重悬于完全培养基中，在 6孔板中接种 1 . 5×1 0 , 5 C O 2、 3 7℃

培养箱中培养 1 8~2 4 h,使细胞达到 6 O ~8 0%的融合。用脂质体介导重组质粒转染，于无菌试管中准备 A、 B两种溶液。A液：将2 g D NA溶于 1 0 0> L无血清培养液； B液：将6 L L i—

p o f e c t a mi n e脂质体溶于 5 O L无血清培养液中。将 A液 B液混合并混匀，室温孵育 3 0 ai r n,已形成 D NA脂质体复合物。弃细胞培养液，用

不含血清的培养液 ( D ME M)洗涤细胞 2次。 0 . 8 mL无血清的 D ME M培养液加入次复合体中，混匀后小心滴加到 B I 6细胞上。然后将 B 1 6细胞放人 5 C 0z、 3 7℃培养

1 P F 2: C TG CTG CTG AGC ATG GGC GGG GCA CGG GC A TCC AGG GAG C CG C TG CGG CCA CTG TGC C 1 PR2: GCA CTG GC G GCA GGA CCG C CT GCA GCA CC C GCA TCA TGG TGG GGC AGT AGC CGG CAC A 1 PF。: CTC AGC TAG CAC CAT GGA GAT GCT C CAGG G GCT GCT GCT GT G G CT GCT GCT GA G CA T G

箱中培养 4 8 h后，至细胞密度达到 5 O ~7 O 融合时，弃培养液，换用含有 G - 4 1 8 ( 4 0 0￣ g/ mL )的 R P MI - 1 6 4 0培养基进行抗

1 PR: ATG GAC TCG AAG CGC ACC TCG CGG TAGTTG CG C ACC ACC TG G G GC ACT GGC GG C AG G A 1 PF: CTC A GC TA G CA C CA T G GA G A

性细胞筛选培养，同时用未转染的细胞作对照。当对照细胞几乎全部死亡时， C o - 4 1 8浓度可降至 2 0 0￣ g/ mL以维持筛选作用。2周后，可见有抗性克隆形成，待其逐渐增大后，用0 . 2 5的胰酶将细胞消化下来，用有限稀释法挑取单克隆并进行扩大培养，获得稳定 B 1 6/ p c D NA3 . 1 (+)一 r m C Gl 3细胞。1 . 2 . 4 B 1 6/ p c D NA3 . 1 (+)一 r mC Gl 3细胞中目的基因的检测

下端引物： 5 -+32 PF1: CA G CTG TCG TTG T GC A CT CTG CCG CCG CA G CA C CT C T GA CT G T GG G GG TCC CA A GGA C

2 P R: AAG AGG AGG C CT GGA GGT GGG GGT CATCA C AG G

TCA A A G GG T GG T CCT TG G G AC CCC C 2P: GCC CG C CT G GCG TGG ACC CCG TGG TCT CCG TTC CCG TG G CTC TCA GCT G TC GTT GT G C

1 . 2 . 4 . 1提取细胞总 RN A

将扩大培养的 B 1 6和 B 1 6/ p c D—

NA 3 . 1 (+)一 r r n C G l细胞用 0 f . 2 5 胰酶消化， 3 0 0 0 r/ mi n离心 3 mi n,收集 1×1 0细胞。弃上清，加入 l mL P B S重悬细胞， 3 0 0 0 r/ mi n离心 3 mi n,弃上清，加入 1 mL Tr i z o l试剂重悬沉

2 P R2: AGT CC G GAT GGA CTT GGA GGG CTG GGGG GA GGG TCC TTT G A G G AA G AG GA G G CC TGG A 2PF3: A AC T AC CG C G A G GT G CG C TT C G A G T CC A TC CGG CTC CCT GG C T GC CCG CCT GGC G TG G 2PR: CCG G A T A TC T TG CG G G AG G AA CGG G TT G TC T GC TG G CTC CAG GA G TCC GG A TGG A CT T

淀，使细胞充分裂解。按试剂盒说明书进行余下操作。最后将提取的总 R NA溶解在高温消毒过的 1 0 0> L超纯净水中，取 2 L稀释 5 O倍，紫外分光光度计上测定 OD 2 6 0和 O D2 8 0比值，计算 RN A的浓度和纯度。得到的 R NA分装为每管2 O L,保存于一8 O℃备用。 1 . 2 . 4 . 2 目的基因的检测采用 T a Ka R a一步法 R T _ P C R试剂盒，以B 1 6和 B 1 6/ p c D NA 3 . 1 (+)一 r mC G￣细胞总 R NA为

2 P R4: C CG GAT ATC TTG CGG GAG GA

P C R扩增体系 1 O x P C R b u f f e r不含 Mg C 1 2为 5 L,Mg C 1 2为 2 5 mo l/ L为 5 L, d N TP mi x l 0 0 mM/ mL为 4 L, P F 1

模板，用1

P F 4和 2 P R为引物分别进行扩增，逆转录条件为：5 O℃3 0 mi n, 9 4℃2 ai r n。P C R反应参数为： 9 4℃预变性 2 mi n一 9 4℃变性 3 0 s - -￣ 5 8℃退火 3 O s一7 2℃延伸 l mi n,循环 3 5次后 7 2℃延伸 7 mi n一4℃∞。取 5 1 . t L P C R产物在 1 . 2 琼脂糖凝

为 1 L, P R1为 1 L, T a q D NA聚合酶 5 u// L L为 1 L,双蒸水至5 0“ L。P C R反应参数为： 9 4℃预变性 3 mi n -+9 4℃变性 1 mi n 一5 7℃退火 l mi n - -￣ 7 2℃延伸 l mi n,循环 5次后 7 2℃延伸 3 mi n

胶进行电泳分析。2 结果

一4℃保存 P C R产物，取 2 p . L用 1 . 2 琼脂糖凝胶电泳，紫外线观察结果，并摄像证实为目的基因后，进入下一轮 P C R。将前一轮 P C R产物稀释 1 0 0倍后取 1 L作为下一轮模板，各经3轮 P C R后产物加入 1 P F 4: 1 L, 2 P R : l t * L,后 3轮 P C R的

2 . 1 目的基因的构建 (图1 )经 4轮 P C R反应后，扩增产物经1 . 2 琼脂糖凝胶电泳，得到了一条大小为 5 1 7 b p左右的单一

条带，产物大小与预期一致，未见非特异性扩增的杂带及拖b p 1 2 3 4 S 8 T

P C R扩增程序是把 5个循环周期改为 3 1个循环周期，其余条件相同。 1 . 2 . 2重组质粒构建和鉴定将切胶回收纯化的 r mC G￣c D— N A,与P GM- T e a s y载体连接，转化 J Ml O 9大肠埃希杆菌并扩增，用博大泰克 P C R片断快速回收提取试剂盒提取，方法按试

尾现象。

剂盒说明书。用限制性内切酶酶切鉴定，鉴定正确的菌种，由

上海生工生物技术公司测定 D NA序列。按文献[ 6]方法，将纯化的 T— e a s y/ r mC G￣]质粒和 p c D NA3 . 1 (+)质粒，分别用Nh e I和 E c o R V进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳M: DNA分子量标准； 1: 1 P F 1+1 P R1 P CR产物； 2: 1+1 P F z+

分离，回收

并且纯化后，用 T 4 D NA连接酶于 3 7℃水浴箱连接

1 P R2 P C R产物； 3: 2+1 P F 3+1 P R3 P C R产物； 4: P C R产物： r mC G] 3; 5: 6+2 P F 3+2 P R 3 P C R产物； 6: 7+2 P F 2+2 P R2 P C R产物； 7: 2 P F 1+2 P R1 P C R产物。

过夜。连接产物转化 J Ml O 9大肠埃希杆菌，于选择性 L B固体培养基 (含1 0 0> g/ mL氨苄青霉素 )上生长。第 2天随机挑取单克隆菌落培养，琼脂糖凝胶电泳进行初筛后挑选可能带有插入片段的重组质粒进行酶切鉴定。根据真核表达质粒 p c D—NA3 . 1 (+)的序列设计 2条引物，分别从插入端的两端进行正

图 1

目的基因 P C R鉴定

2 . 2重组真核表达质粒的酶切鉴定 (图2 ) 理论上，阳性重

1 5 9O

重庆医学 2 0 0 9年 7月第 3 8卷第 1 3期为癌症检测的灵敏指标 l l g]。h C G l 3在癌细胞中高表达，并与肿

组p c D N A3 . 1 (+)一 r mC G￣质粒经 Nh e I、E c o R V单酶切的结果应切出 5 8 7 6 b p的线性片段，经 Nh e I和 E c o R V双酶切的结果应切出 5 3 5 9 b p的空 p c D NA3 . 1 (+)的线性片段和 5 1 7 b p插入基因片段的 2条条带。图 2显示的酶切结果均与以上预计相符合。b p Ml 1 2 3 辩 2 p

瘤的扩增与衰退呈相关性变化。机体在抵御肿瘤细胞生长增殖过程中，免疫系统发挥极其重要的作用。利用 h C G 3 l作为靶抗原，激发体液免疫反应产生保护性抗体，中和肿瘤细胞分泌的h C O l 3抗原，能抑制、阻断肿瘤细胞 h C G] 3自分泌反馈调节环，特异性的细胞免疫则能更为有效地攻击肿瘤细胞 _ 2 。但提取天然抗原的工艺复杂、成本高，难以满足大规模制备和应用的需要。同时， h C G是一种“自体抗原”,不能产生有效的抗

体。An t i - h C G疫苗是用 h C G的 8链与抗原性很强的载体蛋白2 l

结合，制成的人工抗原。为了提高抗

体滴度，除了寻找更好的蛋白质分子交联剂之外，各国都在研制更新的产生 A n t i— h C G疫苗的方法。

Ml和 M2: D NA分子量标准； 1: Nh e I和 Ec o R V双酶切重组质粒p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣ t片段； 2: Nh e I单酶切重组质粒 p c D NA3 . 1(+)~ r mC G￣片段； 3: Ec o R V单酶切重组质粒 p c DNA3 . 1 (+)一 r mC G￣片段。

r mC G] 3和h C G I 3在 e DN A水平上的同源性高达 9 0 . 6,

在蛋白水平上的同源性达 7 9 . 5, S u n d a r a m等报道 r mC G和h C G存在明显的免疫交叉反应。陈云等【 l。 检测了 p C MV 4一 r mC G￣在 He L a细胞中表达的情况，并进一步检测了通过药物诱导法免疫接种小鼠后的体液免疫应答情况。其研究结果表

图 2

重组质粒的酶切鉴定

2 . 3 目的基因的序列测定 (图3 ) DN A测序结果显示，重组质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣中插入片段为 5 1 7 b p,与基因文

明，构建的真核质粒表达载体 p C MV4一 r mC G￣能在 He L a细胞中高强度表达，表达的 r mC G￣蛋白主要以细胞内或膜结合的

库中报道的恒河猴绒毛膜促性腺激素 8亚基的基因序列1 0 0 同源，插人方向正确，未改变恒河猴绒毛膜促性腺激素口 亚基基因的阅读框架，保证了编码氨基酸序列的正确表达 (由 上海生工生物技术公司测定 )。

形式存在，将质粒 p C MV 4一 r mC G￣D NA通过药物诱导后接种至小鼠肌肉，小鼠骨骼肌细胞能够吸收质粒 D NA,并表达编码的r mC G￣蛋白抗原，表达的 r mC G￣被小鼠的免疫系统识别，

产生抗 r mC G￣的抗体。本研究通过 P C R克隆扩增 r mC G￣全长基因 c D NA序列，

将该基因插入真核表达质粒 p c D NA 3 . 1 (+)多克隆位点 Nh e工和 E c o R V之间，获得了表达 r mC G￣的重组真核表达质粒 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣。用

酶切鉴定和基因测序分析所构建的重组 p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣质粒正确，为进一步开展该基因的新功能研究和以 r mC G￣为靶点的免疫生物治疗奠定了基础。

参考文献：ge l s o n W .H a ve w e f oun d t he”de f i ni t i v e c a nc e r b i o— [ 1 2 Re

r mC G 0的核苷酸序列分析。

ma r k e r”? T he di a gn os t i c an d t h er a pe u t i c i mp l i c a t i on s o f hu ma n c h or i o ni c g on a do t r o pi n b e t a e xp r e s s i on as a ke y t o

图 3

重组质粒的测序鉴定

2 . 4细胞株 B 1 6/ p c D NA 3 . 1 (+)一 r mC G￣中 r mC G￣的检测 (图4 ) 本实验以细胞株 B 1 6/ p c D NA3 . 1 (+)一 r mC G￣总R NA

ma l i g n a n c y[ J] . C a n c e r, 1 9 9 5, 7 6 ( 8 ): 1 2 9 9 .Mo u h o n HM, Yo s h i h a r a PH,M a s o n DH, e t a 1 .Ac t i v e

为模板，经R T— P C R反应后，得到 1条大小为 5 1 7 b p左右的单一

s p e c i f i c i mmu n o t h e r a p y wi t h a l? - h u ma n c h o r i o n i c g o n a—d o t r o p i n p e p t i d e v a c c i n e i n p a t i e n t s wi t h me t a s t a t i c c o l o r— e c t a l c a n c e r:a n t i b o d y r e s p o n s e i s a s s o c i a t e d wi t h i m—

条带，产物大小与预期一致，未见非特异性扩增的杂带及拖

尾现象，而阴性对照 B 1 6细胞株未获得。1 2 蘸 bp

p r o v e d s u r v i v a l[ J] . C l i n C a n c e r Re s, 2 0 0 2, 8 ( 7 ): 2 0 4 4 .i oz z i PL, S t e ve ns VC.H um a n c ho r i o n

i c g on a do t r o pi n a s [ 3] T r

a t a r g e t f o r c a n c e r v a c c i n e s[ J] . O n c o l R e p, 1 9 9 9, 6 ( 1 ): 7 .i o z z i P L, S t e v e n s VC, Al d r i c h W[ 4] Tr51 7

, e t a 1 . Ef f e c t s o f a b e—

t a— - hu ma n c ho r i o ni c g on a do t r o pi n s ubu ni t i mm u no ge n a d—。

mi n i s t e r e d i n a q u e o u s s o l u t i o n wi t h a n o v e l n o n i o n i c b l o c k

c o p o l y me r a d j u v a n t i n p a t i e n t s w i t h a d v a n c e d c a n c e r[ J] .M: D NA分子量标准； 1:未转染任何质粒的 B 1 6细胞的 R T— P C R 产物； 2:B 1 6/ p c DNA3 . 1 (+)~ r mC GI 3 R T- P C R产物。Cl i n C a n c e r Re s, 1 9 9 7, 3 ( 1 2 Pt 1 ): 2 3 5 5 .i s s l e r M[ 5] Ge, Wa n d s G, Ge s i e n A, e t a 1 . Ge n e t i c i mmu n i z a—

图43讨

p c D NA3 . 1 (+)一r mC G l 3转染 B 1 6细胞的R T— P C R产物鉴定

t i o n wi t h t h e f r e e h u ma n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n b e t a s u b—u n i t e l i c i t s c y t o t o x i e T l y mp h o c y t e r e s p o n s e s a n d p r o t e c t s

论

a g a i n s t t u mo r f o r ma t i o n i n mi c e[ J] . L a b I n v e s t, 1 9 9 7, 7 6( 6 ): 8 5 9 .

近来研究发现，几乎所有恶性肿瘤细胞均能选择性分泌单链 h C Gp或h C Gp的核心片段，完整的 h C G及其他内分泌激素

[ 6] 萨姆布鲁克著

,金冬雁译.分子克隆 (下转第 1 5 9 3页 )

在癌细胞中则未检测到]。而且 h C G B与 h C G的比值可作

重庆医学 2 0 0 9年 7月第 3 8卷第 1 3期转染移植血管后对 c— my c蛋白表达抑制作用有叠加效应。3讨论

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内膜增生有明显的协同作用，这为针对血管狭窄发生涉及的不同病因和病程发展的不同阶段，联合调控多个基因防止血管狭窄提供了参考。参考文献：

由于移植器官内的血管狭窄的多基因性，单基因治疗具有较大的局限性，因此，从不同角度、不同环节或不同侧面调控多个基因似乎能够阻止血管狭窄。许多学者在研究中发现 P D GF是一种重要的促细胞分裂剂，可刺激 V S MC和成纤维细胞等增殖；损伤的 VE C、激活的血小板及移行于 VE C下的

[ 1 1 Mi t c h e l l, R i c h a r d N. Al l o g r a f t a r t e r i o p a t h y: P a t h o g e n e s i su p d a t e[ - J] . C a r d i o v a s c P a t h o l, 2 0 0 4, 1 3 ( 1 ): 3 3 .

单核巨噬细胞均能以自分泌、旁分泌释放大量的 P D G F,促进 V S MC生长、增殖、迁移和转型 3 ]。原癌基因 c - m y c是细胞完成生长和分化调控的必需基因，表达的 c - my e蛋白与 D NA结

[ 2]蔡文琴.现代实用细胞与分子生物学实验技术 I - M] .北京：人民军医出版社， 2 0 0 3: 1 7 7 .

[ 3 3 Mo o n S K, Ki m HM, Ki m C H, e t a 1 . P T E N i n d u c e s G1c e l l c y c l e a r r e s t a n d i n h i b i t s MMP - 9 e x p r e s s i o n v i a t h e r e g u l a t i o n o f NF - e B a n d AP~ 1 i n v a s c u l a r s mo o t h mu s c l e

合后激活增殖基因，引起细胞增殖，在损伤等始动因素作用下c— my c基因迅速出现扩增，转录的 mR NA和释放的蛋白质大

量增加，不断激

活增殖基因，使细胞过度增生[ 5]。因此，如能控制P D G F基因和 c - my c基因表达有望阻止 VS MC增殖。有学者在血管局部单独给予 P DG F - A OD N或 c - my c - AOD N以抑制 VS MC增殖，收到了一定的疗效l _ 6 ],但还不能完全阻止血管狭窄的发生。本研究设想通过同体移植血管 (排除免疫排斥反应干扰)建立动脉损伤模型，用“鸡尾酒”的方法，在移植血管局部联合应用 P DG F - AOD N和 c— my c - AO DN,期望二者能协同作用，抑制 P D G F和 c— my c的表达，从而阻止 VS MC的增殖，

c e l l s[ J 1 . Ar c h B i o c h e m B i o p h y s, 2 0 0 4, 4 2 1 ( 2 ): 2 6 7 .[ 4] Ki n g s l e y K, Hu f f J L, Ru s t WL, e t a 1 . E R K1/ 2 me d i a t e sP DGF - BB s t i mu l a t e d v a s c u l a r s mo o t h mu s c l e c e l l p r o l i f—

e r a t i o n a n d mi g r a t i o n o n l a mi n i n - 5[ J] . B i o c h e m B i o p h y sRe s Co mm u n, 2 0 0 2, 2 9 3 ( 6 ):1 0 0 0 .

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I - 6 - 1曲乐丰，景在平，曹贵松.手术缝线携带反义基因预防血

企图达到防止血管内膜增生的目的。研究结果显示：移植血管局部联合转染 P D G A0 D N和 c— my￣A OD N后，血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和 P D G F阳性细胞及 c - my c阳性

管吻合口内膜增生的实验研究[ J] .中华普外科杂志，2 0 0 2, 1 7 ( 1 ): 3 6 .

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a l l o g r a f t a r t e r i o s c l e r o s i s u s i n g a n t i s e n s e p r o l i f e r a t i n g -.

细胞数均显著低于对照组 ( P< 0 . 0 1 ),而且联合转染 P D GF - A O DN和 c— my c - AO D N组血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和 P D G F阳性细胞及 c— my c阳性细胞数亦明显低于单独转染 P D GF - AOD N组或 c _ my A OD N组( P< 0 . 0 5 ),说明联合转染 P D G F - AO D N和 c - my c - AO D N比单独转染 P D G F -AO D N或 c - my c _ AO D N效果更好，对抑制 VS MC增殖、阻止

c e l l n u c l e a r a n t i g e n o l i g o n u c l e o t i d e[ J 1 . T r a n s p l a n t a t i o n,2 00 0。 7 0: 3 9 8.

(收稿日期： 2 0 0 9 - 0 2— 1 3 )

(上接第 1 5 9 0页 )

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r i o n i c g o n a—d o t r o p i n￣ - c o r e f r a g m e n t i s d i r e c t l y p r o d u c e d b y c a n c e r c e l l s

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