高效液相色谱法原理与应用-

高效液相色谱法原理与应用参考书 《高效液相色谱及其应用》 《液相色谱检测方法》 《实用高效液相色谱法的建立》

第1章 色谱基本原理一、色谱法概述1. 2. 3. 4.

色谱法的定义与特点 色谱法的分离原理 色谱法的特点 色谱法的分类

1.色谱法的定义

茨维特的实验

色谱分离效果图

因此 色谱法是一种分离方法。– 它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。

Chromatography 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。– 色谱分析是一种分离、分析法。

2、色谱法分离原理 当流动相中所携带的混合物流过固定相 时，就会和固定相发生作用(力的作用)。

由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差 异。因此在同一推动力作用下，不同组 分在固定相中的滞留时间有长有短，从 而按先后不同的次序从固定相中流出。6

3、色谱法的分类

按流动相状态的不同，可分为 气相色谱法 (GC) 液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱 (SFC)

什么是气相色谱法？ 以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatogaphy,简称GC 适合分离分析易汽化(在- 190℃-500℃范围内有 0.2-10mmHg的蒸气压的)稳定、不易分解、不易 反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的 分离。

应用举例(GC)

什么是液相色谱法？ 以液体为流动相的色谱法 Liquid Chromatogaphy,简称LC 适合分离分析高沸点、热不稳定、离 子型的样品。

按固定相使用的形式可液相色谱法又可 分为：柱色谱(Column Chromatography)将固定相装在色谱柱内

纸色谱(Paper Chromatography)用滤纸做固定相或固定相载体的色谱

薄层色谱(Thin Lay Chromatography)固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上11

TLC的应用Bands 1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8 9

Description Pseudoginsenoside F11 American Ginseng Ginsenoside Rg1 Ginsenoside Rf Ginseng Ginsenoside Rc Ginsenoside Rb1 Notoginseng Notoginsenoside R1

9

人参、西洋参和三七药材的鉴别

DAD1 A, Sig=280,16 Ref=550,100 (H:\1\DAT A\HUPING\DANSHEN6.D) mAU

35 30 25 20 15 10 5 0 -5 10 20 30

11 10 9 7 1 2 3 4 5 6 8 12 13 14 15 16 17 18

40

50

60

min

丹参药材有效成分的HPLC图谱1. Danshensu; 2. Protocatechuic acid; 3. Protocatechualdehyde; 4. Caffeic acid; 5. Salvianolic acid F; 6. Salvianolic acid D; 7. Salvianolic acid J / isomer; 8. Salvianolic acid E; 9. Rosmarinic acid; 10. Lithospermic acid; 11. Salvianolic acid B; 12. Salvianolic acid B / E /isomer ; 13. Salvianolic acid A; 14. Dihydrotanshinone I; 15. Tetrahydrotanshinone / 13 isomer; 16. Cryptotanshinone; 17. Tanshinone I; 18. Tanshinone IIA

拖尾峰 伸舌峰

鬼峰、假峰 畸峰

峰底 基线漂移 基线噪声

谱带扩张

死时间(tM):完全不保留组分流出系统的时间 保留时间(tR): 调整保留时间(t’R): 死体积(VM):' tR tR tM

VM t M F0VR t R F0

保留体积(VR):

' 调整保留体积(V’R): VR' tR F0 (tR tM ) F0

2. 色谱分离基本方程t R ( 2 ) t R (1) R 1 (W1 W2 ) 2

R: 分离度 tR: 保留时间 t0:死时间 W:峰底宽度

不同R值的峰重叠情况示意图

R>1.5可以得到基线分离 分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度 R太小，两个峰无法彻底分离 R太大，分离时间过长，工作效率低下

一般要求R>1.5,也可遵循行业特殊规定

色谱分离基本方程

n R 4

1 k 1 k

根据该公式优化试验条件，提高分离度R。 从数学推导来看，分别增大n,α ,k值，都 可以提高分离度。

分离选择性(α )对分离度(R)的影响

' tR '2 t R1

如果t0=1min α =1.64/1.58=1.04 α =1.15/0.85=1.35 α =0.95/0.63=1.50

改变分离选择性α的方法

改用不同的流动相改变流动相的组成 改变流动相pH值 改变柱温 应用特殊的化学效应 改变固定相20

α并非必须大于1.5! 尽量优化前几种实验条件提高a值， 避免改变固定相(买新柱子),以便降低成本

柱效(n)对分离度(R)的影响

以上两张谱图k,, α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得 它们具有不同的分离度。 直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效 越高，通常使用理论塔板数(n)的大小衡量柱效的高低21