原生质体的培养与体细胞杂交

第九章 原生质体培养和体细胞杂交

本章大纲 9.1 原生质体的分离与纯化 9.2 原生质体培养 9.3 体细胞杂交

什么是植物原生质体？ 什么是植物原生质体？植物原生质体(protoplast)是去掉细胞壁的由质膜 是去掉细胞壁的由质膜包裹、 包裹、具有生活力的细胞 是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料仍保持植物细胞的全能性 仍能进行植物细胞的各种生命活动

是植物遗传转化的理想受体膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、 膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、 DNA 细胞核、 细胞核、甚至 病毒颗粒等

原生质体

植物细胞

9.1 原生质体的分离与纯化9.1.1.1 材料的选择几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 每一部分 叶片、愈伤组织、悬浮培养的细胞都可制备原生质体 叶片、愈伤组织、 叶片是最常用的材料 叶片是最常用的材料 一般选用结构疏松并处于对数生长期 结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 分离原生质体效果较好 一般选用生长旺盛 生命力强的组织作为分离原生质 生长旺盛、 一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质 体的材料

胚性愈伤组织 常用) (常用) 胡萝卜的愈伤组织

胚性愈伤组织( 胚性愈伤组织(embryonic callus ): 能形成体细胞胚的愈伤组织

9.1.1.2 材料的预处理主要的预处理方法： 主要的预处理方法： (1)暗处理 (1)暗处理在分离原生质体前,将在温室内生长5 在分离原生质体前,将在温室内生长5-7周的豌豆 枝条取下后,置于维持一定湿度的暗室中预培养1 枝条取下后,置于维持一定湿度的暗室中预培养1-2天。 获得的原生质体存活率较高,并能继续分裂。 获得的原生质体存活率较高,并能继续分裂。

(2)预培养 (2)预培养把羽衣甘蓝叶撕去下表皮， 把羽衣甘蓝叶撕去下表皮，置于又到愈伤组织的培 养基上预培养7 然后再用酶液脱壁。 养基上预培养7天，然后再用酶液脱壁。 得到的原生质体量虽低于未经处理的对照组， 得到的原生质体量虽低于未经处理的对照组，但 培养时分裂频率提高，并很快形成能生根的愈伤组织。 培养时分裂频率提高，并很快形成能生根的愈伤组织。

(3)预萎蔫 (3)预萎蔫 预萎将叶片置于日光或灯光下2 8h使叶片稍萎 将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片稍萎 蔫，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分 离原生质体。

(4)预质壁分离 (4)预质壁分离把材料先放到与酶溶液中糖浓度相同的糖 溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，

1h左右 溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，然后 再放入酶液去壁。 再放入酶液去壁。 加快原生质体的释放， 加快原生质体的释放，提高原生质体的活 力。

9.1.1.3

分离方法

1. 机械分离法早期研究中借助于 利器(如刀等) 利器(如刀等)或机械 磨损等措施使细胞壁破 损，促使原生质体释放 的方法。 的方法。

2. 酶分离法指用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞的壁解离， 指用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞的壁解离， 以获得原生质体的方法。

⑴ 常用酶的种类 ① ② ③ ④ 纤维素酶(cellulase) 纤维素酶(cellulase) 果胶酶(pectinase) 果胶酶(pectinase) 半纤维素酶(hemicellulase) 半纤维素酶(hemicellulase) 崩溃酶(driselase) 崩溃酶(driselase)

一种活力很强的粗酶制剂，同时具有纤维素酶、 一种活力很强的粗酶制剂，同时具有纤维素酶、果 胶酶以及地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的活性。 胶酶以及地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的活性。

⑤ 蜗牛酶(snailase) 蜗牛酶(snailase)主要用于花粉母细胞、四分体、 主要用于花粉母细胞、四分体、小孢子等中分离原 生质体

⑵ 酶液的配制 使用原则：以用最少的酶制剂种类、最 使用原则：以用最少的酶制剂种类、 少的量，但能分离得到完整、 少的量，但能分离得到完整、健康的原 生质体为准 使用前需要对酶进行纯化 使用前需要对酶进行纯化 在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生 在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生 渗透稳定剂 质体的活力和质膜的稳定性，一般渗透 质体的活力和质膜的稳定性， 稳定剂浓度为0.35 0.35稳定剂浓度为0.35-0.8mol/L 适宜PH:5.4-6.0范围 适宜PH:5.4-6.0范围 PH

常用的渗透稳定剂1、糖醇和可溶性糖包括甘露醇(常用)、山梨醇、葡萄糖、 包括甘露醇(常用)、山梨醇、葡萄糖、 )、山梨醇 蔗糖等

2、无机盐KCl、 CaCl2、MgSO4、KCl、KH2PO4或培养基中的 无机盐组成

稳定剂中附加钙盐(0.1%)可以增强质膜稳定 稳定剂中附加钙盐(0.1%) 钙盐 性 葡聚糖硫酸钾(0.5%-1%)能抑制酶液内某些 葡聚糖硫酸钾(0.5%-1%) 杂酶和RNA酶的活性， RNA酶的活性 杂酶和RNA酶的活性，也有助于质膜稳定 加入少量AgNO3能减少酶解时产生的乙烯 加入少量AgNO 加入过氧化氢歧化酶以减轻O2¯ 自由基对细胞 加入过氧化氢歧化酶以减轻O 过氧化氢歧化酶以减轻 膜的损伤， 膜的损伤，从而提高原生质体的植板率

(3)分离原生质体 ①两步分离法(顺序法): 两步分离法(顺序法):先用果胶酶使细胞分离， 先用果胶酶使细胞分离

,再用纤维素酶解 离细胞壁获得原生质体

②一步分离法(直接法): 一步分离法(直接法):把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶 对材料进行一次性处理，目前多用。 液，对材料进行一次性处理，目前多用。

直接法

分离需注意： 分离需注意： 材料和酶液的体积比： 材料和酶液的体积比： 1:10 温度：25温度：25-30℃ 黑暗或弱光条件 黑暗或弱光条件 一般静置进行 进行， 一般静置进行，每隔一段时间轻轻摇 动几下， 动几下，也可将培养皿一直放在 50r/min的摇床上轻轻振荡来分离原 50r/min的摇床上轻轻振荡来分离原 生质体

9.1.2.1 原生质体的纯化纯化方法

沉降法

漂浮法

界面法

(1)离心沉淀法(沉降法) 离心沉淀法(沉降法)步骤： 步骤：①将收集的含有原生质体和酶液的滤液 低速离心 经离心后，原生质体沉降与管底， ②经离心后，原生质体沉降与管底，上 部为含碎片的混合液。 部为含碎片的混合液。弃去含杂质的上 悬液，重新悬浮原生质体，再次离心， 悬液，重新悬浮原生质体，再次离心， 如此重复3 如此重复3次 用原生质体培养基洗涤一次， ③用原生质体培养基洗涤一次，收集管 底纯净的原生质体， 底纯净的原生质体，用培养基调整到一 定密度后进行培养 优点： 优点：操作简便 缺点：在制备过程中易造成原生质体的损伤，而且纯度不够好， 缺点：在制备过程中易造成原生质体的损伤，而且纯度不够好， 常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体

(2)漂浮法滤液低速离心

优点：收集得到的原生质体较为纯净、 优点：收集得到的原生质体较为纯净、完整 缺点： 缺点：得率较低

原生质体漂浮于溶液表面， 原生质体漂浮于溶液表面，杂吸出原生质体， 吸出原生质体，转入另一离心管中

质下沉到管底

反复

离心和重新悬浮2 离心和重新悬浮2-3次，最后用原生质体培 养基洗涤1 养基洗涤1次后调整到所需密度进行培 养。

(3)界面法 原理：高分子聚合物混合液产生两相水溶液， 原理：高分子聚合物混合液产生两相水溶液，通过离心可使原生质体处于两液相的界面之间

优点：可获得数量较大的纯净原生质体，同 优点：可获得数量较大的纯净原生质体，时避免了在收集过程中原生质体因相互挤压而 破碎

12mL含原生质 体悬浮液

0.45mol/L甘露醇 甘露醇 400g、5min 、

碎片带( 碎片带(比 原生质体轻) 原生质体轻) 含原生质体带

0.6mL 0,45mol/L蔗糖 蔗糖