外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达(2)

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

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江苏农业学报"**"年第!J卷第!期

乏抗虫种质资源，用常规育种方法开展不结球白菜抗虫育种工作难以奏效。

植物转基因技术的成功标志着分子生物学育种手段已步入实用化阶段，为创建不结球白菜抗虫新种质材料和培育抗虫新品种开辟了新的育种途径。由于不结球白菜离体培养植株再生频率偏低，农杆菌介导法基因转化体系不完善，影响了转基因研究工作的进展。随着离体培养和转基因技术的不断改

［!，"］进和完善，近年来应用农杆菌介导法已将豇豆

苷酸链为引物，进行G.7扩增，!A(:/H45I凝胶电泳

检测G.7结果。不结球白菜植株总E3(的G.7产物在!A(:/H45I凝胶电泳后，以#"G标记的!&’$基因片断制作探针，进行杂交。E3(转膜、探针标记、杂交22.洗脱以及胶片放射自显影等操作均按《分

［J］子克隆》方法进行。

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结果

转基因植株自交后代卡那霉素抗性分析经过卡那霉素筛选、抗虫性鉴定和分子检测确

胰蛋白酶抑制剂基因、慈姑胰蛋白酶抑制剂基因、苏云金芽孢杆菌!"#$%基因导入不结球白菜，获得了

［#$%］

抗虫转基因工程植株，并通过有性生殖选择出

［"］抗虫性和卡那霉素抗性可遗传的单株。本研究将

证，抗虫转基因的当代（K*）工程植株中，有中脚黑叶矮脚黑叶=株，自交收获种子。K!代幼苗喷!"株；

洒!-%:;&的卡那霉素溶液，!*<左右部分植株的心叶转白色，并最终!%<后这些植株发育成白化苗，

死亡。具有卡那霉素抗性的正常绿色植株自交后收获种子。K"代幼苗喷洒!-%:;&的卡那霉素溶液，呈现出#种不同类型的株系：全部幼苗发育成绿色植株———卡那霉素抗性纯合型株系（图!）；全部幼苗发育成白化植株，最终死亡———卡那霉素敏感性纯合型株系；部分幼苗长成绿色植株，部分植株白化夭折———杂合型株系（图"）

。

在前期工作的基础上，进一步探讨外源基因———豇豆胰蛋白酶抑制剂（!&’$）基因和新霉素磷酸转移酶（()’*!）基因在不结球白菜转基因植株自交后代植株中的传递与表达。

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材料与方法

供试品种

供试品种不结球白菜“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”

由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。!"#

农杆菌菌株和质粒

农杆菌菌株为&’())*)。质粒+’,!"!-"携带

与豇豆胰蛋白酶抑制剂基./01#%2启动子和345#6，

因构建成植物表达质粒+7.&"8，并带有筛选标记基

［9，8］

。因———新霉素磷酸转移酶基因

!"$卡那霉素抗性筛选

当转基因植株自交后代的种子长出!$"片真

叶时，对幼苗喷洒浓度为!-%:;&的卡那霉素溶液，

!%<后观察统计绿苗和白苗数。!"%

抗虫性鉴定

取转基因植株自交后代植株的叶片，放入直径为=>?的培养皿中，分别投入!*条!$"龄的小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫，于")@培养箱内培养#<后统计死亡的幼虫数，计算幼虫校正死亡率。

幼虫校正处理组死亡率C对照组死亡率

BD!**A

!**AC死亡率（A）

图!./01!

卡那霉素抗性纯合型株系

23435603789/:;</=>?@:@46A/:B;8/8=@:A;

卡那霉素抗性纯合型株系的植株自交后收获种子。其K#代幼苗喷洒!-%:;&卡那霉素溶液后，全

部植株为正常绿色植株。与此同时，来源于杂合型株系的K#代幼苗经!-%:;&卡那霉素处理后，绿苗与白苗继续发生分离。表明，卡那霉素抗性在转基因不结球白菜自交后代中的表达基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。

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’()*+,-杂交分析

选择具有卡那霉素抗性和抗虫性的转基因植株

提取总E3(。以从不结球白菜叶片中提取的总

万方数据人工合成的"#F+和"%F+寡聚核E3(为合成模板，