2.qRT-PCR-生物分析检测技术

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第二节 实时荧光定量 实时荧光定量PCR

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实时荧光定量PCR仪、技术 仪 实时荧光定量 原理及应用一、实时荧光定量PCR仪 实时荧光定量 仪 实时荧光定量PCR的技术原理 二、实时荧光定量PCR的技术原理1. 2. 3. 4. 5. 定量与常规的差别 荧光扩增曲线 荧光阈值和CT值 荧光阈值和 值 熔解曲线 标准曲线

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6. 何为实时？ 何为实时？ 7. SYBR Green I 的工作原理 8. Molecular Beacons(发夹型杂交探针)的 (发夹型杂交探针) 工作原理 9. TaqMan(水解型杂交探针)的工作原理 (水解型杂交探针) 10. 多色多通道技术应用——基因表达分析 多色多通道技术应用 基因表达分析 11. 内标技术介绍 三、 实时荧光定量 实时荧光定量PCR技术的应用介绍 技术的应用介绍 1. 医疗方面 2. 研究方面 3. 其它方面 四、荧光定量PCR 实验室所需仪器设备清单 荧光定量 五、实时定量PCR 及应用于植物分子生物学的 实时定量 研究

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一、实时荧光定量PCR仪 实时荧光定量 仪热循环仪( 热循环仪(PCR仪) 仪 荧光检测系统 计算机及软件系统

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不产热的光源--不产热的光源 发光二极管( 发光二极管(LED) ) 灵敏度高的检测器--灵敏度高的检测器 光电倍增管( 光电倍增管(PMT) ) 优点： 优点： 不产热---无散热装置 无散热装置， 不产热 无散热装置，全封闭 无机械转动装置---抗震性强 无机械转动装置 抗震性强 无需经常校准， 无需经常校准，耐用 灵敏度高 灵敏度高 线性范围广 线性范围广

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Opticon 实时荧光定量 PCR仪 仪荧光检测 热循环仪 光色: 均一性: 光色 蓝色光 均一性 ±0.4°C ° 染料: 染料 FAM, SYBR Green I, Molecular beacons TaqMan Probes 精确性: 精确性 ±0.3°C ° 激发光波长： 激发光波长： 450-495nm 发射光波长: 升降温速率: 发射光波长 515-545nm 升降温速率 最 高3°C/秒. ° 秒 灵敏度: 温度梯度: 灵敏度 <5nM的荧光素 的荧光素 温度梯度 有 检测范围: 检测范围 100 - 108 拷贝 容量: 样品 容量 96样品 反应管: 0.2mL反应管 96 孔板 反应管 反应管& 反应管 操作系统: 操作系统 Windows NT

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二、实时荧光定量PCR的技术原理 实时荧光定量 的技术原理 1.定量与常规的差别 1.定量与常规的差别常规PCR技术： PCR扩增反 常规PCR技术：对PCR扩增反 技术 应的终产物 终产物进行定量及定性分析 应的终产物进行定量及定性分析 定量PCR技术：对PCR扩增反 技术： 定量 技术 扩增反 应中每一个循环的产物 每一个循环的产物进行定量 应中每一个循环的产物进行定量 及定性分析

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SYBR Green I 定量原理确定初始模板的浓度: 初始DNA量越多, 荧 量越多 确定初始模板的浓度 初始 量越 光达到某一值(域值)时所需要的循环数 光达到某一值(

域值)时所需要的循环数 越少 Log浓度与循环数呈线性关系 浓度与循环数呈线性关系：根据样品 Log浓度与循环数呈线性关系 根据样品 扩增达到域值的循环数 达到域值的循环数就可计算出样品中 扩增达到域值的循环数就可计算出样品中 所含的模板量

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实时荧光定量 实时荧光定量PCR:其反应体系中，引入了 定量 ：其反应体系中， 一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行， 反应的进行， 一种荧光化学物质，随着 反应的进行 PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等 反应产物不断累计， 反应产物不断累计 荧光信号强度也等 比例增加。每经过一个循环， 比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光 强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变 强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化， 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩 增曲线。 增曲线。

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2.荧光扩增曲线 2.荧光扩增曲线荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信 荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信 号阶段，荧光信号指数扩增阶段 指数扩增阶段和 号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期 。 荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光 荧光背景信号阶段： 荧光背景信号阶段 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。 平台期： 不再呈指数级的增加。 平台期 扩增产物已不再呈指数级的增加 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关 的终产物量与起始模板量之间没有线性关 所以根据最终的PCR产物量不能计算出起 系，所以根据最终的 产物量不能计算出起 拷贝数。 始DNA拷贝数。 拷贝数 只有在荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量 只有在荧光信号指数扩增阶段 只有在荧光信号指数扩增阶段： 产物量 的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我 的对数值与起始模板量之间存在线性关系， 们可以选择在这个阶段进行定量分析。 们可以选择在这个阶段进行定量分析。

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3. 荧光阈值和 值 荧光阈值和CT值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值 ，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段 它可以设定在荧光信 …… 此处隐藏：1276字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……