高尔基体膜蛋白GP73小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰GP73细胞株的筛选

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436 军事医学科学院院刊 2010年10月第34卷第5期 BullAcadMilMedSc,iVol34,No5,Oct,2010

高尔基体膜蛋白GP73小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰GP73

细胞株的筛选

管 楷

1,2#

,黄 蓓,钟 辉

12

[摘要] 目的 构建高尔基体膜蛋白73(Golgimembraneprotein73,GP73)小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,筛选出稳定干扰GP73的细胞株。方法 根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对GP73的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后,质粒命名为psiGP73。用脂质体转染质粒到肝癌细胞系HepG2中,经G418加压筛选稳定表达GP73siRNA的细胞株,用免疫印迹检测质粒对内源GP73的干扰效果,将干扰效果好的细胞株命名为HepG2/siGP73。用MTT法检测GP73被干扰下调后对细胞增殖的影响。再通过贴壁非依赖性生长试验检测GP73被干扰下调后对细胞贴壁非依赖性生长的影响。结果 免疫印迹结果证实构建的psiGP73质粒能够有效干扰细胞内源GP73的表达。GP73被干扰下调后,HepG2细胞的增殖速度降低,在软琼脂中克隆形成减慢。结论 成功构建了表达GP73siRNA的质粒psiGP73,筛选出稳定干扰GP73表达的细胞株HepG2/siGP73,为深入研究GP73在肝癌发生中的作用提供了平台。[关键词] 高尔基体;膜蛋白质类;RNA,小分子干扰;细胞增殖;质粒[中图分类号] Q244

[文献标志码] A

[文章编号] 1000 5501(2010)05 0436 04

ConstructionofsmallinterferenceRNAplasmidofGP73andscreeningofstablyin terferedcelllinesofGP73(Golgimembraneprotein73)

GUANKai

1,2#

,HUANGBei,ZHONGHui

1*2*

(1.SchoolofLifeSciences,AnhuiUniversity,Hefei230039,China;2.BeijingInstituteofBiotechnology,100850,China)

Beijing

*Correspondingauthors,HUANGBe,iE mai:lbeihuang@http://www.77cn.com.cn;ZHONGHu,iTe:l010 66931809,E mai:ltowal@http://www.77cn.com.cn

[Abstract] Objective ToconstructthesmallinterferenceRNA(siRNA)eukaryoticexpressionplasmidofGolgimem braneprotein73(GP73)andselectthestablyinterferedcelllinesofGP73.Methods AccordingtothereportedsequenceofsiRNAandtheadhesiveendofthevector,twospecificDNAsequencesweredesigned,synthesized,andlinkedtothevec torpSUPER.retro.neo+gfp,whichwasnamedpsiGP73aftersequenceanalysis.Afterwards,psiGP73wastransfectedintoHepG2cellsbyliposome.ThecelllineswhichstablyexpressGP73siRNAwereselectedbyG418.TheinterferenceeffectofendogenousGP73wasdetectedbyimmunoblotting,byMTTandanchorage independentgrowthassay,

andthecelllinewhichstablyinterferedwithGP73wasnamed

HepG2/siGP73.Theeffectofgp73knockdownonthecellproliferationandanchorage independentgrowthwasdetermined

respectively.Results Theresultofimmunoblottingshowedthatthe

HepG2/siGP73cellsexpressedareducedlevelofendogenousGP73protein.TheproliferationrateandcloneformationrateinsoftagarofHepG2wasreducedafterGP73knockdown.Conclusion ThesiRNAeukaryoticexpressionplasmidofGP73isconstructed.CelllineswithstablyinterferewithGP73arescreenedout,whichservesaplatformtoprobeGP73functioninhepatocarcinogenesis.

[Keywords] Golgiapparatus;membraneproteins;RNA,smallinterfering;cellproliferation;plasmids 2000年,Kladney等[1]首先从一位成人巨细胞肝炎患者

[作者简介] 管 楷,男,安徽大学生命科学学院在读硕士研究生,

主要从事肿瘤发生和细胞信号传导的研究

[作者单位] 1.安徽大学生命科学学院,合肥 230039;2.军事医学科学院生物工程研究所,北京 100850;#安徽大学生命科学学院和军事医学科学院生物工程研究所共同为第一单位[通讯作者] 黄 蓓,E mai:lbeihuang@http://www.77cn.com.cn;钟 辉,Te:l010 t的肝组织cDNA文库中克隆得到高尔基体膜蛋白73(Golgimembraneprotein73,GP73)。人类的GP73基因位于9号染色体9q21.33位置,其cDNA全长约1.2kb,编码一个具有401个氨基酸的蛋白质,相对分子质量约为45 103。多篇文献报道,GP73作为早期肝细胞癌诊断标志物,其敏感性和特异性都要明显超过甲胎蛋白( fetoprotein,AFP),有潜力更为有癌诊

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军事医学科学院院刊 2010年10月第34卷第5期 BullAcadMilMedSc,iVol34,No5,Oct,2010 437

物[2~4]。为了进一步研究GP73在肝癌发生中的可能作用,我们设计合成2条针对GP73的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后,质粒命名为psiGP73。用脂质体转染质粒到肝癌细胞系HepG2中,用免疫印迹检测质粒对细胞内源GP73的干扰效果,并筛选出稳定干扰GP73表达的细胞株。用MTT法检测GP73被干扰下调后细胞增殖速度的变化,发现GP73干扰下调导致细胞增殖速度降低。用贴壁非依赖性试验检测GP73被干扰下调后细胞在软琼脂中克隆形成情况的变化,发现GP73干扰下调导致细胞在软琼脂中克隆形成减慢。

室温孵育1h,然后加入稀释的内源GP73抗体4 孵育过夜。TBST洗膜3次后,加入稀释的辣根过氧化物酶偶联的驴抗羊IgG,室温孵育1h,TBST洗膜3次,然后将含有辣根过氧化物酶底物的化学试剂滴加到膜上,随即在暗室中压片显影。1.2.4 MTT法检测细胞增殖 将处于对数生长期的细胞以2 104/ml接种于96孔培养板中,每孔100 l培养体系中约有2000个细胞。每组实验设6个复孔。在37 、5%CO2培养箱培养24h后,一组每孔分别加入10 l的MTT试剂(5mg/ml),培养箱中孵育4h后,吸出残留液体。每孔加DMSO150 ,l震荡10min,酶联仪检测D490值。

1.2.5 贴壁非依赖性生长试验 按1 9混合5%低熔点琼脂和新鲜培养基,浇入6孔板中制成0.5%下层琼脂。按 …… 此处隐藏：6751字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……