及浓度发生改变,否则会影响所分离的蛋白质纯度。
2. 可用20%三氯乙酸溶液代替磺基水杨酸溶液来检验洗脱液中有无蛋白质。
3. 用HCl处理DEAE-纤维素时,时间不宜过长,否则DEAE-纤维素会发生变质。
5. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白质分离纯度的原理是什么?
答:以聚丙烯酰胺凝胶作为载体
由丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺聚合交联而成。
引发剂是过硫酸铵,催化剂为四甲基乙二胺。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
还原剂β 巯基乙醇,它能破坏蛋白质的二硫键,使蛋白质的构象和形状改变,几乎全部呈长椭圆棒状,
6. 不连续凝胶电泳的支持体由什么组成?
答:由分离胶和浓缩胶组成。上层为浓缩胶,一般Acr为2% ~ 3%,缓冲液为不同浓度的Tris-HCl、pH值为6.8左右;下层为分离胶,Acr为5% ~ 10%,缓冲液常用Tris-HCl,pH值为8.8。上、下电泳槽盛有pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液,上电泳槽接电源的负极,下电泳槽接正极。
7.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中应注意的是什么?
答:1)丙烯酰胺(Acr) 和双丙烯酰胺(Bis) 有很强的神经毒性,最好戴手套、口罩。
2)不要用洗衣粉和刷子擦洗电泳平板玻璃板。
3)微量进样器针头极易堵塞,吸样后应及时清洗;玻管中的金属芯子不宜拔出,防止弯曲和弄脏。
4)吸取溶胶的滴管、吸管等,要立即排空和冲洗,以防凝固堵塞。
5)实验过程中,注意勿弄破平板玻璃。
8、指示剂:溴酚蓝;染色剂:考马斯亮蓝;步骤:取样、制胶、电泳、剥胶、染色
9、浓缩胶中迁移率:cl->蛋白质->甘氨酸-
实验四 碱性磷酸酶的Km值测定
1. 碱性磷酸酶的Km值测定实验原理是什么?
以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4—氨基安替吡啉作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比。
2. 请写出Michaelis-Menten方程
答: 上式中Vmax为最大反应速度,[S]为底物浓度,Km为米氏常数,而其中的V则表示反应的起始速度。
2. 何谓Km?
米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。大多数酶的Km值在0.01~100 mmol/L间。
5.实验中应注意的是什么?
答:1.血清取量要准确。2.酚标准曲线必须是过原点的一条直线。
第五版块生物学实验技术在医学研究中的应用
实验一 血清谷-丙转氨酶活性测定
1. 血清谷-丙转氨酶活性测定的原理是什么?
以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,在谷-丙转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸,再利用显色剂2,4-二硝基苯肼与丙酮酸反应,生成丙酮酸二硝基苯腙。此化合物在碱性溶液中呈棕色
2. 实验中应注意的是什么?